酶促反应动力学-精品医学课件

（3）酶与底物结合是通过一种称为诱导契 合模式进行的。
酶促反应动力学
概念：
• 研究酶促反应速率及其影响因素。 • 反应速率：单位时间内底物减少或产物
增加的速率，常用初速率来衡量。
初速率
产 酶促反应速率逐渐降低
物
0
时间
酶促反应的时间进展曲线
影响酶促反应速度的因素：
• 底物浓度[S] • 酶浓度[E] •T • pH 值 • 抑制剂 • 激活剂
• 加样量的准确性 • 温度与时间的准确性 • 分光光度计的校准和使用
➢ 开启电源，仪器预热20分钟。
➢ 波长调至测试用波长（510nm）。
➢ 将比色皿架处于空白管位置，打开试样室盖，选 择“T”档，调节“0”按钮，使数字显示为“0.00”。
盖上试样室盖，使光电管受光，调节透过率 “100%”按钮，使数字显示为“100.0”。
可逆性 非竞争性抑制
类型
反竞争性抑制 不可逆性
可逆性抑制作用的动力学比较
作用特点 无抑 竞争 非竞争 反竞争 制剂 性抑制 性抑制 性抑制
与I结合组分
E
E、ES ES
动力学参数
表观Km Km
Km
表观Vm Vm Vm

本次实验方案
底物：磷酸苯二钠 酶： 碱性磷酸酶AKP 抑制剂：磷酸氢二钠
v
v=Vm=K3[E]
V= Vmax [S]
Vm
Km + [S]
2
Km
[S]
底物浓度对酶促反应速度的影响
(二)米---曼氏方程 （Michaelis-Menten equation）
Vmax [S] V=
Km + [S]
1、米-曼氏方程解释： 当[S]Km时，v=(Vmax/Km) [S], 即v 正比于 [S] 当[S]Km时，v Vmax, 即[S]而v不变
可见光光度法：用可见光光源测定有色物质 也称为比色分析法。
SPECTROPHOTOMETER 分光光度计结构
光源
单光色器
吸收杯
光电放大器
待测液 (浓度C)
单色光器
入射光 强度 I0
出射光 强度 I
光杯厚度
L
A= -lgI/I0=KCL
A=-lgI/I0=KCL
❖A为消光度 (吸光度) Absorbance A=OD（光密度） =optical density ❖L:比色杯厚度Depth of solution
（三） Km与 Vmax的意义
1、Km值等于最大反应速度一半时的底物浓度；
2、 k2k3 时Km可用来表示酶对底物的亲和力
大小， Km与酶对底物亲和力大小成反比； 3、 Km值是酶的特征性常数之一，
Km值范围在10-6 ~ 10-2mol/L 4、 Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与
酶浓度呈正比；
4.任何液体不能滴落和污染仪器
1.可以一人做无抑制剂的，另一人做有抑制剂的 实验。
2.取样量准确,保温准确，加样顺序要一致，每 步均混匀。
3.同一组实验用相同的比色计。
4.作图时,实验点不在同一条直线上时,尽量使各 点平均分布在直线的两侧,两图画在同一坐标 纸上,便于判断。
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果 • 讨论 • 结论
加入0.5Mol/L NaOH 1.0 ml(迅速混匀，终止反应) 加入0.3％4－氨基安替比林1.0ml
加入0.5％铁氰化钾2.0ml.(氧化作用)，充分混匀 室温放置10分钟
510nm比色，测定OD值(6号管校正零点)
结果处理： 以pH值为横坐标,吸光度A为纵坐 标绘图,描述pH值对酶促反应速率 影响，找出该酶的最适pH。
当底物浓度较低时,V随[S]的增大而急剧上升,两 者成正比关系.随着底物浓度继续增加,反应速率增 加,而幅度不断下降,若继续加大[S]反应速度率就 不再增加,达到一个极限值Vmax.
(V)
Vmax
[S]
[S]与V的关系:米-曼氏方程
Vmax [S] V= Km + [S]
Vmax -- 最大速率 Km -- 米氏常数
验方法； • 验证竞争性抑制剂对酶促反应速率的影响。。
实验原理
酶促反应酶动促力反学应: 动力学的研究对象是酶 促反应速率和各种因素对它的影响。 影响酶促反应速率(V)的因素:
1.底物浓度 [S] 3.温度[T] 5.酶的激活剂
2.酶的浓度[E] 4.pH
6.酶的抑制剂[I]
（一）底物浓度对酶促反应速率的影响
1.观察[S]与V之间的关系 2.观察抑制剂的作用 3.最适pH
ONa
O-P=O + H2O
ONa
磷酸苯二钠
AKP
ONa
OH + HO-P=O
ONa
酚
C6H5 N
H3C-N C=O +
H3C-C C-NH2
4-氨基安替比林
C6H5
OH
K3Fe(CN)6
N
H3C-N C=O
OH-
H3C-C C-N=
酶促反应动力学实验 Experiments on kinetics of enzyme-catalyzed reactions
实验目的
• 了解分光光度法的原理； • 熟练使用分光光度计；
• 通过实验加深关于PH对酶活性影响的理解； • 明确酶作用的最适PH的概念及其缘故； • 学习和掌握米氏常数（Km）的测定原理和实
五、抑制剂对酶促反应速度的影响
抑制作用: 直接或间接地影响酶的活性中心,使酶活 性降低或丧失。 抑制剂：凡能降低酶活性而不引起酶蛋白变性的 物质。
一、不可逆抑制（irreversible inhibition）
抑制剂与酶的必需基团以牢固的共价键结合, 使酶 丧失活性, 不能用透析超滤等物理方法除去抑制剂使酶 恢复活性.
5、 k3为酶的转换数：当酶被底物充分饱和 时，单位时间内每个酶分子（或活性中 心）催化底物转变为产物的分子数。 1~10 4/s
（四 ）Km值与 Vmax值测定
1、双倒数作图法又称林-贝氏作图法（1934）
1
Km 1
1
=
+
V Vmax [S] Vmax
1/V
斜率= Km/ Vmax
1/Vmax -1/Km 0
❖C:溶液浓度Concentration of absorbing solution
❖K:消光系数Extinction coefficient
• T ( Transmittance,透光率)=I/I0
• Percent T=I/I0x100
(百分透光率)
• A (Absorbance,消光度,吸光度)=-lgT
结果处理：
根据A值,计算不同底物浓度时酶的反应速度（以产物的 生成量表示）,以1/V-1/[S]双倒数作图，获得Km值。
操作步骤（三） 1.首先按照下表加样
表3
（加入酶液立即计时，迅速混匀）快，准 37℃ 水浴15分钟
加入0.5Mol/L NaOH 1.0 ml(迅速混匀，终止反应) 加入0.3％4－氨基安替比林1.0ml
例1： 巯基酶的抑制
SH E + Hg2+
SH
SH Cl E + As-CH=CHCl
SH Cl 巯基酶 路易士气
S
E
Hg + 2H+
S
S E As-CH=CHCl + 2HCl
S
二、可逆抑制(reversible inhibition)
抑制剂与酶以非共价键疏松结合引起酶 活性的降低活丧失, 结合是可逆的, 能够通过 透析、超滤等物理方法使酶恢复活性。
O
醌衍生物
醌衍生物为紫红色,利用分光光度计测出紫红色溶液的深浅， 即光吸收值（A）,A 与产物的浓度成正比，而产物的浓度可 以代表着酶促反应速率。
实验原理
分光光度法
• 应用分光光度计测定溶液的吸收光谱及其 对某一波长光线吸收能力，是对物质进行 定性或定量检查的方法。
分光光度法分类
• 紫外与可见光分光光度法
1/[S]
四、pH对酶促反应速度的影响
酶
的
A
B
活
性
2
8 10 pH
pH对某些酶活性的影响 A: 胃蛋白酶; B: 葡萄糖-6-磷酸酶
酶的最适pH: 酶催化活性最高时的pH。
一些酶的最适 pH 值
酶
最适 pH
胃蛋白酶
1.8
过氧化氢酶
7.6
胰蛋白酶
7.7
延胡索酸酶
7.8
核糖核酸酶
7.8
精氨酸酶
9.8
则
A=-lgT=-lgI/I0=kcl
即 A=kcl
Lambert-Beer定律
A=KCL
K、L不变 A1=KC1L A2=KC2L 即：A1/A2=C1/C2
溶液的颜色和光吸收的关系
• 溶液的颜色，是由于不同的有色物质有 选择地吸收某种颜色的光而引起的。
• 溶液呈现的颜色是 与它吸收的光互补的光的颜色。 溶液吸收的光越多， 呈现的颜色越深。
操作步骤（二） 1.首先按照下表加样
表2
（加入酶液立即计时，迅速混匀）快，准 37℃ 水浴15分钟
加入0.5Mol/L NaOH 1.0 ml(迅速混匀，终止反应) 加入0.3％4－氨基安替比林1.0ml
加入0.5％铁氰化钾2.0ml.(氧化作用)，充分混匀 室温放置10分钟
510nm比色，测定OD值(6号管校正零点)
当V＝1/2Vmax时，Km ＝［S］
Km值的物理意义: Km值是当酶反应速率达到最大反应速率一半时
的底物浓度; k2k3 时Km可用来表示酶对底物的亲和力大
小，Km与酶对底物亲和力大小成反比。
Km和Vmax值的测定
(1)测定不同底物浓度的反应初速率，以V-[S]作 图可以得到Vmax，再从1/2Vmax，可求得相应
黄 580~600nm
橙 600~650nm
红 650~750nm
绿 500~580nm
白光
紫 400~450nm
青 490~500nm
青蓝 480~490nm
蓝 450~480nm
光的互补色示意图(/nm)
操作步骤（一） 1.首先按照下表加样 表1
基质液即底物溶液（含有磷酸苯二钠）
（加入酶液立即计时，迅速混匀）快，准 37℃ 水浴15分钟
酶的概念
酶是由生物细胞合成的以蛋白 质为主要成分，对底物起高效催 化作用的生物催化剂。
还有一类具有催化作用的核酸核酶（ribozyme）
酶－底物复合物（中间产物学说）
1、中间产物学说：
E+S k1
ES k3 E+P
k2
2、酶与底物结合特点：
（1）可逆的、非共价的结合；
（2）底物只与酶的活性中心结合；
的 [S]，即Km值。
v ½ Vmax
Vmax
Vmax [S] V= Km + [S]
[S] Km
Km和Vmax值的测定
(2)双倒数作图法：将米氏方程式两侧取双倒 数，以1/V-1/[S]作图，得出一直线.
（二）抑制剂对酶促反应速率的影响
酶的抑制剂：使酶的活性下降而不引起酶蛋白 变性的物质。
竞争性抑制
2.根据Linewever-Burk方程作图求出Km值。
3.根据林－贝氏作图法 求出有竞争性抑制剂存 在情况下的酶促反应的表观Km值，并判断本 次实验为何种类型的抑制作用。
[作图]
1/V 1/Vmax
-1/Km
根据图获得Km,并 判断磷酸氢二钠为何种 抑制剂.
1/[S]
• 加样器的正确使用
• 移液管的正确使用（特别注意每种试剂 的专用管不可混用）
可逆抑制类型：
竞争性抑制 (competitive inhibition) 非竞争性抑制（non-competitive inhibition） 反竞争性抑制（uncompetitive inhibition）
➢ 吸光度的测量，将选择开关置于“A”，调节吸光 度调零按钮，使数字显示为"0.00"，然后将被测 样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度值。
1.比色杯光学表面不能有任何污 损，否则会引起光吸收的增加。
2.比色杯的外表面应以高质量的柔软擦 镜纸或绸布擦干净，不能使用易磨损比 色杯的滤纸。
3.装液量不能超过2/3,用前润洗.
了
• 比色分析法
解 内
容
• 红外光谱法
• 荧光光度法
• 化学发光分析法
• 定性检测 1.核酸 2.蛋白质 • 定量检测
紫外分光光度法
比色分析法
许多物质本身具有一定的颜色，也有许多 物质本身无颜色在加入适当的显色剂后生 成有色物质。
溶液浓度越大，颜色越深。因此可以利用 比较溶液颜色深浅的方法来测定有色溶液 的浓度。
加入0.5％铁氰化钾2.0ml(氧化作用)，充分混匀 室温放置10分钟
510nm比色，测定OD值(6号管校正零点)
结果处理：
根据A值,计算不同底物浓度时酶的反应速度（以产物 的生成量表示）,林-贝氏双倒数作图,根据图形判断该抑 制剂是对AKP是何种抑制方式。
实验结果的处理
1.以pH值为横坐标,吸光度A值为纵坐标绘图,描 述pH值对酶促反应速率影响，找出该酶的最 适pH。
一、底物浓度对酶促反应速度的影响
v
Vm
0.3
0.2
[S]与v关系：
Vm
当[S]很低时，[S]与v成比例-- 一级反应
2
当[S]较高时，[S]与v不成比例
0.1
当[S]很高时8 [S]
（一）矩形双曲线：
v =（Vm/Km） [S]