实验氨基酸分离鉴定

实验一、氨基酸的分离鉴定
——纸层析法
一、实验目的
通过氨基酸的分离,学习纸 层析法的基本原理及操作技 术.
二、实验原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层 析法.利用不同物质在两种互不相溶的溶剂中的分 配系数不同而得到分离.
展层剂由有机溶剂与水组成.在纸上,水被吸附 在纤维素的纤维之间形成固定相,当有机相沿纸流 动经过层析斑点时,层析点上的溶质就在有机相和 水相之间进行分配.当有机相不断流动时,溶质就沿 着有机相流动方向移动,不断进行分配,溶质中各组 分的分配系数不同,移动速率不同,因而彼此分开.
四、试剂
1、扩展剂：按体积4:1:3的正丁醇：冰醋酸：水
混合后倒入分液漏斗中,充分振荡,静置后分层
排出水相
80 ml /组
2、平衡剂：取漏斗中的扩展剂5ml 于烧杯中作 平衡剂.
3、氨基酸：0.5%赖、脯、缬、苯丙、亮氨酸溶 液及各组分的混合氨基酸各5ml.
五、操作
1、取层析滤纸一张,在纸的一端距边缘23cm处用铅笔画一条直线,在此线上每间 隔2cm作一记号〔即原点〕如图.
物质结构与性质
物质的极性大小决定了物质在水和有机 相之间的分配情况,其极性的大小主要取 决于物质所具有的极性基团的性质和数 量,在极性基团不改变情况下,非极性基团 成分越多,则分子极性越低等.
展层方式
上行法 下行法 环形法 <辐射法〕
三、器材
层析缸、毛细管〔用钢笔代 替〕、喷雾器、培养皿、层 析滤纸〔新华一号〕
图1-2 滤纸缝合示意图
5、显色：用喷雾器均匀喷上0.1% 的茚三酮 正丁醇溶液,干燥.
6、计算：用铅笔描出各层析斑点的轮廓,并 计算各氨基酸的Rf 值.
图谱示
化学方法：显色剂不与滤纸起反应,挥发 性小,易于去除,含水量少.
物理方法 微生物方法 同位素和放射自显影法
须知：
1、要保证层析滤纸不被污染,特别是从 点样线到溶剂前沿的部分.
2、点样：用钢笔或毛细管将氨基酸样品 分别点在这6个位置上,干后再点一次.每 点在纸上扩散的直径不超3mm.点样量
溶剂前沿 层析点
原点
3、平衡：点样好的滤纸卷成圆筒状用线缝好 与盛有平衡剂的小烧杯,置于密闭的层析缸 中,平衡1-2小时.
4、扩展：将盛有约20ml左右扩展剂的培养皿 迅速置于密闭的层析缸中,并将滤纸直立于 培养皿中,密闭好层析缸.待溶剂上升到15— 20cm时即取出滤纸,立即用铅笔描出溶济前 沿,吹风机或烘箱干燥.
2、各氨基酸样品点样时量要均匀. 3、在缝滤纸时,纸的两边不能接触. 4、点样的一端朝下,扩展剂的液面需低
于点样线1cm.
六、实验结果
样品aa 赖aa 脯aa 缬aa 苯丙aa 亮aa
标样Rf 混合aaRf 差值
七、分析讨论
八、思考题
做好本实验的关键是什么？ 实验过程中,为何不能用手直接接触滤纸? 影响 Rf值的因素有哪些？
各组分由于移动速度不同,物质被分离后在层析 纸上的位置也不同,可用Rf 值来表示：
原点到层析点中心距离 Rf ＝ ———————————
原点到溶剂前沿的距离
在一定的条件下某物质的Rf值是常数,可作为定 性分析的依据. Rf 值大小与样品物质的结构性质、 溶剂系统、层析滤纸的质量及展层方式、温度、样