生物化学实验示范报告-蔗糖酶的提取与纯化(正确)

生物化学实验示范报告:

实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化

实验目的:

1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法；

2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理；

3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法；

4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。

实验原理：

蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。酶分离提纯的原理与蛋白质的相同。但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。

有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。

蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。

蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。在本实验条件下，每3min释放lmg还原糖所需的酶量定义为一个活力单位；通过Folin法测定酶蛋白的含量，计算蔗糖酶的比活。单位质量的酶蛋白中所含酶的活力称为酶的比活。

主要实验器材：

1. 试管、血糖管；

2. 秒表；

3. 冰盐浴；

4. 恒温水浴；

5.离心机；

6. 721- 型分光光度计；

7. 柱层析装置； 8. 梯度洗脱装置；9. 部分收集器；10. 电磁搅拌器；11. 冰箱；12. DEAE—纤维素。

实验操作

1．蔗糖酶的分离提纯

（1）．蔗糖酶粗品的制备流程：

250mL具塞三角瓶＋酵母粉＋1.5g乙酸钠＋25mL甲苯于35o C恒温水浴中搅30min →补加水60mL，搅匀，用塑料薄膜封口，35℃保温过夜→自溶液于4000r/min离心20min，取中间水层液再次在4000r/min 离心20min，得无细胞抽提液（初酶E1）→测量初酶液的体积V1，并取出5mL待测酶活力和酶蛋白浓度。

实验得到的初酶液体积V1 = 48.5 mL，留5mL测酶活及酶蛋白，其余43.5mL做后续纯化实验。

（2）．乙醇分级和透析流程：

将43.5mL初酶液用稀醋酸调节pH值至4.5 → 32％的乙醇饱和度除杂蛋白（计算所需95％乙醇的量并与初酶液在冰盐浴中预冷，缓慢滴加95％乙醇并不断搅拌。滴加结束后，于4000r／min离心5min，留取上清液）→再用95％乙醇调节酶液到47.5％的乙醇饱和度，沉淀蔗糖酶（此时需准确计算出使粗酶液的乙醇浓度达47.5％时所需补加95％乙醇的体积；按上述方法加入乙醇后于4000r／min离心5min）→透析（沉淀立刻用10mL 0.005mol／L，pH6.0的磷酸钠缓冲液溶解后，转入透析袋中，将透析袋放入500mL 烧杯中，加清水透析过夜（中间换一次清水）→次日，将透析液离心得酶液E2 ，准确测量出酶液E2的体积Ｖ2，并取出5mL待测酶液，测定酶的活力和蛋白浓度。

实验得到的乙醇分级和透析纯化后的酶液体积为13.8 mL，考虑到初酶液留下的5mL，则纯化后的酶液体积校正后应为：V2 = 13.8 ×48.5 / (48.5-5) = 15.39 (mL)。

问题1: 乙醇分级纯化的目的是什么？分级纯化后透析的目是什么?

2：乙醇分级和透析纯化后的酶液体积为什么需要进行校正？如何较正？

（3）．DEAE—纤维素离子交换层析法纯化：（由于实验条件和学时数所限，此步省略）

2．牛血清蛋白和葡萄糖标准曲线定制

（1） Folin 法定制牛血清白蛋白标准曲线：按表1进行实验操作，并记录A 650nm 处测得的各浓度对应的OD 值，一并填入下表中。再以蛋白质的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，即可得到标准曲线。

表1 Folin 法定制牛血清白蛋白标准曲线实验加样操作及数据记录表

试管编号

01234567200ug/mL 标准牛血清蛋白溶液/mL 0.000.300.400.500.600.700.800.90.03mol/L pH7.8磷酸缓冲溶液/mL 1.00

0.70

0.60

0.50

0.40

0.30

0.2

0.1

加Folin 试剂甲，充分振荡10min 后，加入Folin 试剂乙A 650nm

0.000

0.155

0.189

0.250

0.305

0.352

0.417

0.459

1mL 4mL

立即摇匀放入55℃水浴中保温5min

取出后用自来水冷却1min ，以0号试管为空白对照，在595nm 处比色测定OD 值

表2 Folin 法定制牛血清蛋白标准曲线微机数据统计表

0#1#2#3#4#5#6#7#0.0010.0013.3316.6720.0023.3326.6730.000.000.1550.1890.250

0.305

0.3520.4170.4590.00

0.150

0.201

0.2530.3050.356

0.408

0.459

实验数据的相关性因素( r )

线性回归方程斜率 ( a )线性回归方程截距 ( b)线性回归方程

0.0155-0.0046

Y = 0.0155X - 0.0046

0.9990

试管编号

标准牛血清蛋白显色浓度 ( ug / mL )回归方程对应浓度下的吸光度A 650nm 实验测试对应浓度的吸光度