植物培养材料的灭菌与接种

实验三植物培养材料的灭菌与接种
一、实验目的
培养材料的灭菌与接种是组织培养过程中一个重要环节。

通过实验，了解无菌操作的重要性，熟悉无菌培养对实验材料消毒、接种的要求，掌握材料灭菌、接种的操作技术。

二、实验用具和药品
1. 实验用具：超净工作台、镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯、培养皿、培养瓶等。

2. 药品试剂：0.1%HgCl2、75%酒精、灭菌蒸馏水、培养基用各类试剂药品等。

三、实验材料
丹参Salvia miltiorrhiza：所用材料为丹参实生苗的叶片和茎段
四、接种前的准备
（一）按培养材料的要求，配制培养基(1-8)。

（二）接种室准备:将接种用具（解剖刀、镊子）、培养皿、无菌蒸馏水、培养基等置于超净工作台上，打开超净工作台开关，确认接种台正常送风后，开机30min。

然后向台内用喷雾器喷洒70%-75%酒精或用紫外线照射15min进行灭菌。

五、培养材料的表面灭菌
灭菌原则：（1）考虑药剂对各类菌种的灭杀效力
（2）考虑植物材料对杀菌剂的耐受力
灭菌方法：（1）选取生长状况良好的嫩叶外植体，放入广口瓶中酌情予以冲洗，取出，置于灭菌的广口瓶中备用。

（2）先倒入70%-75%酒精，摇动两三下（＜30s），立即将酒精倒出，然后倒入0.1%HgCl2溶液，浸泡8～10min。

浸泡过程不断摇动，然后在超净台上用灭菌蒸馏水洗3~5次，接种。

六、培养材料的接种
（1）接种前用肥皂洗手，特别是将手指洗净，然后沾以70%酒精的棉球消毒手，尤其是指甲缝。

（2）去掉三角瓶上的皮筋，把三角瓶按培养基处理整齐排列在接种台左侧，然后用70%酒精棉球把台面擦拭一遍。

（3）将接种所用器械沾以70%酒精，在酒精灯上灼热灭菌。

灼热灭菌后置支架上，不得再行污染。

（4）材料处理：将叶片在无菌滤纸上切割成适宜大小的切块。

（5）轻轻打开纸盖，将三角瓶口在火焰上方灼热灭菌（瓶口转动一圈），然后
置酒精灯右侧。

七、培养材料的置床
在酒精灯上方，左手握住三角瓶，右手用镊子将材料切快在培养基表面摆放均匀。

在酒精灯火焰上转动三角瓶一圈使瓶口灼热灭菌。

然后封口、标记。

八、实验要求
1.每人选择一种外植体进行接种，每小组必须使用两种限定材料，其中应包括
1-8号培养基，并在培养瓶上注明接种时间，接种人姓名。

2.组长负责，每组必须将本组所配培养基全部用于接种。

3.接种完成后，置2414培养室进行培养，并定期观察、记录实验结果，完成实
验报告。

4.培养其间如果发生污染，必须先灭菌后再处理材料，不可直接丢弃。

5.本学期实验工作完成后，必须及时将实验材料移出培养室。