过表达TRIM69抑制细胞内源c-Jun蛋白的表达

过表达TRIM69抑制细胞内源c-Jun蛋白的表达

王任先;李凯;姚荣彦;缪时英;王琳芳;宋伟

【摘要】目的探索TRIM69负调控AP1信号通路及抑制内源c-Jun蛋白表达的分子机制.方法在子宫颈癌细胞HeLa细胞或人胚肾细胞HEK293T细胞共转染荧光素酶报告基因质粒和空载体或TRIM69,共转空载体组作为对照,通过双荧光素酶报告基因实验检测了TRIM69对8条关键信号通路的影响;在HEK293T细胞过表达TRIM69全长及各个结构域的截短体,通过Western blot实验检测了TRIM69抑制细胞内源c-Jun蛋白表达的关键结构域;在HEK293T细胞过表达TRIM69,利用cycloheximide (CHX)、MG132或chloroquine分别处理细胞,通过蛋白稳定性实验探讨了TRIM69负调控内源c-Jun蛋白表达的分子机制.结果 TRIM69可以特异负调控AP1信号通路(P＜0.05),并且TRIM69对内源c-Jun蛋白表达的抑制作用依赖于其RBCC结构域(P＜0.05),进一步研究发现TRIM69通过蛋白酶体途径影响内源c-Jun蛋白的稳定性(P＜0.05).结论 TRIM69负调控AP1信号通路并通过蛋白酶体途径影响内源c-Jun蛋白的降解.

【期刊名称】《基础医学与临床》

【年(卷),期】2016(036)006

【总页数】5页(P767-771)

【关键词】TRIM69;AP1信号通路;转录因子c-Jun

【作者】王任先;李凯;姚荣彦;缪时英;王琳芳;宋伟

【作者单位】北京积水潭医院北京市创伤骨科研究所骨组织工程研究室,北京100035;中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学

国家重点实验室,北京100005;中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室,北京100005;中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室,北京100005;中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室,北京100005;中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室,北京100005;中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室,北京100005

【正文语种】中文

【中图分类】R34

TRIM家族是一个含有RING-finger结构域的E3泛素连接酶家族[1]。TRIM家族的名称是由于其具有3个保守的结构域而得来的，这3个保守的结构域从N端到C端依次是: RING结构域(R)、B-box(B)结构域以及Coiled-coil(C)结构域，这3个结构域又称为tripartite motif，此外该家族蛋白还有一个可变的C-末端，因此这个家族也被称作RBCC家族[2]。在过去几年里，得益于大规模基因组测序的发展，人们鉴定出的TRIM家族的成员已经达到70多个，使之成为了最大的含有RING结构域的E3泛素连接酶家族[3- 5]。TRIM家族蛋白在体内参与非常广泛的生理病理进程，如转录调节、细胞增殖、凋亡、发育以及肿瘤发生等。TRIM家族蛋白的突变与许多复杂的病理进程相关，如发育紊乱、神经退行性疾病、病毒感染以及癌症等[3,6]。TRIM69是从人睾丸cDNA文库扩增得到的1个新基因，含有保守的RBCC结构域，是TRIM/RBCC家族新成员。最近的研究发现，TRIM69具有自身泛素化的特性，是新的E3泛素连接酶[7]。利用RNAi技术在基因组水平筛选与非小细胞肺癌耐化疗药物相关的关键基因时，发现TRIM69在细胞有丝分裂时的中心体聚集过程中发挥重要作用，推测TRIM69可能协调多个分子事件从

而与细胞有丝分裂的高度保真密切相关[8]。但关于TRIM69参与的信号通路及其

发挥生物功能的具体分子机制尚无报道。

前期的研究发现，在模式动物斑马鱼中敲低TRIM69，会导致斑马鱼中、后脑之间的发育发生异常，神经元凋亡显著增加，但具体的分子机制尚不明确。本研究旨在进一步明确TRIM69引起该表型的分子机制，为研究TRIM69的生物功能提供依据。

1.1 材料

人胚肾细胞HEK293T细胞、子宫颈癌细胞HeLa细胞(本研究室保存)。表达质粒

p3XFLAG-CMV- 14、pcDNA6/myc-HisB、cis-Reporter Plasmids(本研究室保存)。质粒转染所用Lipofectamine 2000(Invitrogene公司)。双荧光素酶报告基

因检测系统试剂盒(Promega公司)。Protein G Agrose、蛋白酶抑制剂混合片(Roche公司)。anti-Flag、anti-HA抗体、氯喹和MG132(Sigma公司)。anti-c-Jun抗体(BD公司)。anti-GAPDH抗体(Santa Cruz公司)。HRP/FITC标记的二

抗(中杉金桥生物公司)。BCA蛋白质浓度测定试剂盒(Pierce公司)。ECL化学发光显色试剂盒(英格恩生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：HEK293T和HeLa细胞经常规复苏后，用10%胎牛血清的完全

培养基于37 ℃、5% CO2的细胞孵箱中培养。

1.2.2 双荧光素酶报告基因分析实验：将HeLa或HEK293T细胞接种于24孔板，细胞汇合度达到60%时转染以下8组质粒：1)TK(表达Renilla荧光素酶)+AP1(表达Firefly荧光素酶)、TK+AP1+TRIM69；2)TK+NFκB、TK+NFκB+TRIM69；3)TK+sBE4、TK+sBE4+TRIM69；4)TK+SRE、TK+SRE+TRIM69；5)TK+CRE、TK+CRE+TRIM69；6)TK+INF、TK+INF+TRIM69；7)TK+GRE、

TK+GRE+TRIM69和8)TK+NFAT、TK+NFAT+TRIM69。转染后30 h收集细胞，