双缩脲法测蛋白质浓度

一、目的：
1.了解双缩脲法测定蛋白质浓度的基本原理。

2.熟悉双缩脲法测蛋白质浓度的实验操作方法。

二、原理：
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出1个分子氨后得到的产物在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。

凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过1个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。

测定范围为1~10mg蛋白质。

干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。

主要缺点是灵敏度差。

因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

三、实验试剂和仪器
1.硫酸铜、酒石酸钾钠、NaOH、KI、酪蛋白
2.双缩脲试剂：取0.75g硫酸铜和
3.0g酒石酸钾钠溶于250ml蒸馏水，加入
150ml 10%NaOH溶液（可另加0.5gKI以防止Cu2+自动还原成一价氧化亚铜沉淀），用水稀释至500ml。

此试剂可以长期保存。

3.10mg/ml标准蛋白溶液：取1.0gNaOH加入500ml蒸馏水中，配成
0.05mol/lNaOH溶液。

用0.05mol/lNaOH溶液溶解0.25g酪蛋白，定容至25ml。

4.待测样品液：可以用酪蛋白配制，也可用蛋清，牛血清蛋白。

5.仪器：容量瓶，试管，移液管，量筒，烧杯，胶头滴管，吸耳球，洗瓶，分
光光度计
四、步骤
标准曲线的绘制（表1）。

表1
加入物加入量（ml）
0 1 2 3 4 5
标准液0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.05mol/l
NaOH
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
双缩脲试
剂
4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
室温下振荡均匀，显色30min后，用分光光度计于540nm测定各管吸光度。

以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。

样液配制（表2）。

表2
加人物0.05m
ol/l的
NaOH
空白
牛血
清蛋
白原
液
稀释5
倍牛
血清
蛋白
稀释
10倍
牛血
清蛋
白
稀释
20倍
牛血
清蛋
白
稀释
30倍
牛血
清蛋
白
20mg/
ml酪
蛋白
溶液
稀释4
倍
20mg/
ml酪
蛋白
样液0.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
（ml ） 0.05m ol/l 的NaOH 1.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 双缩脲试剂
4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 室温下振荡均匀，显色30min 后，用分光光度计于540nm 测定各管吸光度。

根据标准曲线计算个样品浓度。

五、结果
标准曲线1
0 1 2 3 4 5 蛋白质浓度
（mg/ml ） 0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 光密度 0.000 0.088 0.169 0.260 0.350 0.426
00.10.20.30.4
0.50
2
4
681012
标准曲线1
y = 0.0430x+0.0007
R^2 = 0.9995
蛋白质浓度
光密度
光密度标准曲线
分析结果
牛血清蛋白原液
稀释5 倍牛血清蛋白 稀释10倍牛血清蛋白 稀释20倍牛血清蛋白 稀释30倍牛血清蛋白
20mg/ml 酪蛋白溶液
稀释4倍20mg/ml 酪蛋白
光密度 0.773 0.541 0.235 0.127 0.085 0.637 0.200 样液蛋白质浓度（mg/ml ）
17.96 12.57 5.45 2.94 1.96
14.80 4.63
蛋白质原浓度(mg/ml) 17.96 62.82 54.48 58.74 58.81 14.80 18.54
六、讨论
1.为提高准确度将之前标准曲线绘制的蒸馏水换成0.05mol/lNaOH溶液。

样液
+蒸馏水+双缩脲试剂的总体积为5ml，体积不一样，蛋白质浓度计算不方便。

2.标准曲线选择不能只看R2，还应该看曲线斜率和截距。

R2大小与实验操作
和仪器都有关系。

3.配蛋白质溶液应用的是0.05mol/L的NaOH配制，用0.05%NaOH可能会影
响干酪素的溶解效果。

（但实验结果分析显示，低浓度的NaOH对实验结果影响不是很大）
4.显色时间过长，可能会出现雾状沉淀，影响比色。

（解决方法：显色时间一过，尽快比
色）
5.脂肪性物质会影响反应。

（可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上澄清液再测）。