MTT实验报告

实验报告
MTT实验
一、实验原理
MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490 nm。

波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。

这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。

因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 mL的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22 μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。

在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

MTT一般最好现用现配，过滤后放4℃，避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时
间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。

配制MTT时用PBS（ph=7.4）溶解。

PBS配方：NaCl 8 g＋KCl 0.2 g ＋Na2HPO4 1.44 g ＋KH2PO4 0.24 g调pH 7.4，定容1 L。

二、实验目的
1. 利用胶束测试细胞毒性(MTT法)，选择的细胞为：HeLa细胞、L929细胞和HepG2细胞，测试48 h内不同聚合物胶束浓度下细胞的存活率。

2. 制备含有负载不同浓度的DOX药物载体，利用MTT法，选择的细胞为：HeLa 细胞、L929细胞和HepG2细胞，测试48 h内负载不同浓度DOX的药物载体细胞的存活率。

3. 对于负载药物的DOX药物载体，利用CLSM(共聚焦激光扫描显微镜)，观察在0.5 h, 1 h, 2h, 4 h, 8 h细胞中的成像问题。

三、实验方法
将状态良好的细胞消化，用培养液稀释至3×104cells/mL细胞密度，吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液100 μL，置培养箱中孵育24 h使其贴壁。

待细胞贴壁后加药。

本实验中药物溶液与胶束制剂的配制和稀释均用培养液，并用0.22 μm 滤膜无菌过滤。

受试溶液每孔加入100 μL，每个浓度3个平行孔；对照组，即不加待测药液，单一补加100 μL培养液,置培养箱中和细胞共同畔育。

于加药后48、72和96 h，将96孔板取出，每孔加入2 mg /mL MTT溶液50 μL，置培养箱中鮮育4 h后甩板，将96孔板倒扣于滤纸上充分吸干残留液体后，每孔加入200 μL DMSO于振荡器上振荡10 min以溶解蓝紫色结晶物。

设定A1孔(只含有200 μL DMSO)为调零孔。

使用酶标仪在570 nm处测定各孔调零后的吸光度值。

三、配置不同浓度的胶束以及负载不同浓度DOX的药物载体，使终浓度分别为
0.1、1、10、100、500 μg/mL。

精密称取一定质量的聚合物材料，通过透析法或者溶剂挥发法制备聚合物胶束，量取一定量的浓溶液并稀释为一系列浓度的聚合物溶液，用0.22 μm无菌滤头过滤除菌后，待用。

取处于对数生长期的细胞，适量胰蛋白酶消化后计数，加入适量RPMI1640培养基稀释为细胞浓度为80000个/mL的细胞悬液，于96孔细胞培养板上每孔各接种100 μL稀释好的细胞悬液，即每孔含8000个细胞。

培养4 h待细胞贴壁60后,各加入l(HiL待测聚合物囊泡
溶液,使终浓度分别为0.1、1、10、100、500 μg/mL。

培养板的最外周孔加200 μL PBS，实验室仅使用外周孔之内的孔。

且每个浓度均设5个复孔，并设置5个阴性对照孔(无细胞，只加培养基，不加实验样品溶液)，5个阳性对照孔(细胞混悬液，但不加实验样品溶液)。

分别培养24 h、48 h、72 h后，于酶联免疫检测仪上570 nm处测定吸光度值。

药物MTT法实验步骤
1贴壁细胞：
(1). 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μL，铺板使待测细胞调密度1000- 10000 /孔，（细胞浓度的问题见后面的注意事项）。

(2). 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午）加药.一般5-7个梯度，每孔100 μL，设3-5个复孔。

建议设5个，否则难以反应真实情况。

(3). 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

(4). 每孔加入10 μL MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。

若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

(5). 终止培养，小心吸去孔内培养液。

(6). 每孔加入100 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。

在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。

(7). 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。

2悬浮细胞：
(1). 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/mL（细胞浓度的问题见后面的注意事项），按次序将①补足的1640（无血清）培养基40 μL；②加Actinomycin D（有毒性）10 μL用培养液稀释(储存液100 mg/mL，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10 μL；④细胞悬液50 μL（即5×104cell/孔），共100 μL 加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。

每板设对照（加100ml 1640培养液）。

(2). 置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

(3). 每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。

（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm （630nm校准）测量各孔的吸光值）
(4). 离心（1000转x10 min），小心吸掉上清，每孔加入100 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。

在酶联免疫检测仪OD570 nm （630nm校准）测量各孔的吸光值。

(5). 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。

共聚焦显微镜定性观测
首先将盖玻片用75%乙醇擦拭，放至6孔板中，在紫外灯下分别照射盖玻片的正反面。

然后再将HeLa细胞、L929细胞或HepG2细胞以1×l05/孔/2.5 mL接种于6孔培养板中，置于CO2培养箱中培养24 h。

24 h后，用37o C的1640培养液(无血清)洗漆2-3次，于培养箱中培养30 min。

小心弃去培养液，加入2.5 mL 的0.5 μg/mL阿霉素溶液和载药胶束于HeLa细胞、L929细胞或HepG2细胞，分别于37o C恒温摇床中振荡1 h和3 h，解化结束后，弃去培养液，加入4o C的PBS终止细胞摄取，PBS洗3次。

加入70%乙醇平衡3 min，PBS洗3次。

然后加入含0.3%-0.5% TritonX-100（100(聚乙二醇辛基苯基醚）以增加细胞通透性,PBS洗3次。

在暗室下，向盖玻片上加入1 mLDAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）溶液，37o C摇床振荡1 h。

弃去溶液，PBS洗3次，取出盖玻片，置于滴有封固液的载玻片上，于共聚焦显微镜下观察。

(DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。

因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。

)
五、实验预期结果
1.聚合物胶束具有较好的生物相容性，不同浓度聚合物胶束的细胞存活率相差不大。

2.通过CLSM可以观测到负载DOX的聚合物胶束在细胞中的位置，从而得到不同时间段DOX到达细胞中的位置，以此来验证聚合物胶束可以作为药物载体在以后的医学中的应用。

六、注意事项：
(1) 选择适当得细胞接种浓度和培养时间。

一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。

但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以防止细胞过满。

这样，才能保证MTT结晶形成的量与细胞数呈的线性关系。

否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。

因此，很多高手总结出“宁少勿多”的原则，这一原则在大多数情况下是适用的。

对于体积大，增殖快的细胞，比如肿瘤细胞，在96孔板中不能接种太多数目的细胞。

一般应该少于104个/孔。

同时，细胞贴壁后不可培养过久，以防过于密集。

大多数肿瘤细胞最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。

对于体积小，增殖慢、悬浮的细胞，在96孔板中可以接种更多数目的细胞。

甚至可以超过105个/孔。

同时，为了观察药物对这类细胞的效果，可以较上一种细胞培养更长时间。

在做肿瘤细胞的时候，往往要根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是48小时还是72小时。

(2) 设置调零孔（只加培养基100 μL、MTT10 μL、二甲基亚砜100 μL）。

(3) 设置空白孔（细胞、药物溶解介质、培养液共100 μL、10 μLMTT 、100 μL 二甲基亚砜）。

(4) MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。

(5) 96孔板边缘32孔用无菌PBS填充,因为边缘的32孔中水分蒸发很快，药物易被浓缩，对实验影响大。

同时加入pbs液填充后，可以一定程度上保持中间孔的水分。

(6)防止药物与MTT反应。

如果96孔板中加入了具有氧化还原性的药物，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建议你用PBS将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可能是你不需要的。

(7) 吸收值分析，在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理的空白组的吸收值应该在0.8-1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围。

这个原理在朗伯-比尔定律中有解释。

(8)培养过程中换液，100 μL的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持50h以上，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果。

如果培养时间长，在48h应该换液一次。

(9) 避免血清干扰，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。

由于试验本底增加，会试验敏感性。

因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。

在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

(10)判断污染如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性極大。

在加MTT前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的。

(11)加DMSO前要把液体小心吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，可在这之前先用平板离心机离心96孔板，2000r，5分钟，然后吸掉上清(如果是悬浮细胞，则推荐此法,悬浮细胞要离心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圆底型96孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉。

对于贴壁细胞，可以试着将96孔板倾斜30度角，然后用枪尖慢慢吸。

古今名言
敏而好学，不耻下问——孔子
业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随——韩愈
兴于《诗》，立于礼，成于乐——孔子
己所不欲，勿施于人——孔子
读书破万卷，下笔如有神——杜甫
读书有三到，谓心到，眼到，口到——朱熹
立身以立学为先，立学以读书为本——欧阳修
读万卷书，行万里路——刘彝
黑发不知勤学早，白首方悔读书迟——颜真卿
书卷多情似故人，晨昏忧乐每相亲——于谦
书犹药也，善读之可以医愚——刘向
莫等闲，白了少年头，空悲切——岳飞
发奋识遍天下字，立志读尽人间书——苏轼
鸟欲高飞先振翅，人求上进先读书——李苦禅
立志宜思真品格，读书须尽苦功夫——阮元
非淡泊无以明志，非宁静无以致远——诸葛亮
熟读唐诗三百首，不会作诗也会吟——孙洙《唐诗三百首序》
书到用时方恨少，事非经过不知难——陆游
问渠那得清如许，为有源头活水来——朱熹
旧书不厌百回读，熟读精思子自知——苏轼
书痴者文必工，艺痴者技必良——蒲松龄
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