固相萃取-衍生化-气相色谱-质谱法测定水中类固醇类雌激素

固相萃取-衍生化-气相色谱-质谱法测定水中类固醇类雌激素罗庆;孙丽娜;杨悦锁;胡筱敏
【摘要】采用固相萃取-衍生化-气相色谱-质谱法同时测定水中4种类固醇类雌激素雌酮(E1)、17β-雌二醇(E2)、17α-乙炔基雌二醇(EE2)、雌三醇(E3).样品经Oasis HLB固相萃取柱,以丙酮为溶剂进行洗脱后,采用吡啶、N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺于40℃衍生化20 min后,采用气相色谱-质谱仪分析.E1、E2、EE2和E3的线性范围分别为5.00～500 μg·L-1和10.0～500μg·L-1,4种类固醇类雌激素的检出限(3S/N)在1.5～3.0 μg·L-1之间,测定下限(10S/N)在5.0～10 μg·L-1之间;方法用于实际水样的分析,加标回收率在86.8％～93.8％之间,测定值的相对标准偏差(n=7)在7.1％～11％之间.
【期刊名称】《理化检验-化学分册》
【年(卷),期】2015(051)010
【总页数】5页(P1406-1410)
【关键词】气相色谱-质谱法;类固醇;雌激素;固相萃取;衍生化
【作者】罗庆;孙丽娜;杨悦锁;胡筱敏
【作者单位】沈阳大学区域污染环境生态修复教育部重点实验室,沈阳110044;东北大学资源与土木工程学院,沈阳110004;沈阳大学区域污染环境生态修复教育部重点实验室,沈阳110044;沈阳大学区域污染环境生态修复教育部重点实验室,沈阳110044;东北大学资源与土木工程学院,沈阳110004
【正文语种】中文
【中图分类】O657.63
类固醇类雌激素是一类可通过干扰体内天然荷尔蒙的合成、分泌、传输、结合、作用或排除等过程来改变内分泌功能的内分泌干扰物（EDCs）［1］，其浓度水平低至ng·L－1级就能够对水生生物产生雌激素效应［2］，且长期毒性风险也比其他EDCs高2～3个数量级，已被引起广泛关注。

环境中典型的类固醇类雌激素有动物和人体内天然存在的雌酮（E1）、17β－雌二醇（E2）、雌三醇（E3）和人工合成的用于口服避孕药物的17α－乙炔基雌二醇（EE2）。

环境中的类固醇类雌激素主要是由人类和动物的新陈代谢产生的，随着尿和粪便等排泄物进入废水中，经过污水处理厂处理后进入自然水体环境中。

目前，在国内外的一些污水处理厂的进水和出水中均检测到类固醇类雌激素［3－4］，更严重的是在河湖等地表水体甚至地下水中也可检测到［5－6］。

这些进入环境中的类固醇类雌激素再次进入人和动物体内后，将模拟细胞内雌激素作用或改变该雌激素活性、干扰内分泌系统的正常功能，使动物致死、致癌和致畸、影响性分化和生殖、改变动物行为以及影响动物体内正常的代谢功能［7］。

鉴于类固醇类雌激素的重大危害，应立即展开环境水体中类固醇类雌激素水平的调查分析。

目前，水环境中类固醇类雌激素的检测方法主要有利用雌激素物质的生物学特性的生物学测试方法（免疫法和受体结合法）［8］、液相色谱法（LC）、液相色谱－质谱法（LC－MS）［9］、气相色谱法（GC）和气相色谱－质谱法（GC－MS）［10］等。

由于生物学测定方法只能检测雌二醇并且灵敏度较低，而LC－MS需要昂贵的仪器设备，因此，GC－MS将广泛应用于环境水体中类固醇类雌激素的分析。

本工作通过对比分析6种常用衍生化方法的衍生化效果，确定了E1、E2、EE2和E3等4种类固醇类雌激素的最佳衍生化方法，结合固相萃取，建立了环境水样中
E1、E2、EE2和E3的分析方法。

1 试验部分
1.1 仪器与试剂
TRACE GC Ultra－PolarisQ 型气相色谱－质谱仪，配 AI／AS 3000型自动进样器；MG－2200型氮气吹扫仪；Milli－Q型超纯水机；Visiprep TM大体积采样器，Oasis HLB固相萃取柱（500 mg／6mL）。

混合标准储备溶液:1.00 g·L－1，称取E1（纯度为99.5%）、E2（纯度为98%）、EE2（纯度为98.2%）和E3（纯度为99.5%）各10.0 mg，分别溶于10mL甲醇中。

将上述溶液配成0.01 g·L－1的E1、E2、EE2和E3的混合标准溶液，放入冰箱（－20℃）冷冻待用，使用时稀释成至需质量浓度。

所用试剂均为色谱纯，试验用水为超纯水。

1.2 GC－MS分析条件
1）色谱条件 TR5－MS型石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；色
谱柱升温程序:初始温度50℃，保持2 min；以12℃·min－1速率升至260℃，保持8 min；最后以3℃·min－1速率升至280℃，保持5 min。

进样口温度280℃；载气、辅助气均为氦气（纯度为99.999%），载气流量为1mL·min－1（恒流）；进样方式为不分流进样，不分流时间0.75 min；进样量为1μL。

2）质谱条件电子轰击离子源（EI），电离电压70 e V；离子源温度250℃，传输线温度280℃；溶剂延迟时间15 min；全扫描模式定性，扫描范围m／z 50～600，以选择离子扫描模式（SIM）定量。

4种类固醇类雌激素的保留时间、定性
离子和定量离子见表1。

表1 E1、E2、EE2和E3的保留时间和扫描离子Tab.1 Retention time，scanning ions of E1，E2，EE2 and E3化合物保留时间／min质荷比m／z定
性离子定量离子E1 24.22 342，257，218 342 E2 24.42 416，285，232 285
EE2 26.51 425，285，232 425 E3 28.12 504，386，311 311
1.3 试验方法
1.3.1 固相萃取
水样用棕色瓶采集后立即加入体积分数为1%的甲醛以防止微生物对类固醇类雌激素的降解，经0.45μm玻璃纤维滤膜过滤后，于4℃下避光保存。

Oasis HLB固相萃取柱依次用乙酸乙酯5mL、甲醇5mL和水15mL活化；取水样500mL，以约
1mL·min－1速率过固相萃取柱，然后用甲醇－水（1＋9）混合液10mL清洗小柱，真空抽干60 min，然后用丙酮10mL洗脱，流量为1mL·min－1。

1.3.2 衍生化
标准溶液或SPE洗脱液经氮气吹干，然后加入吡啶50μL、MSTFA 100μL，涡旋10 s后，于40℃下反应20 min，冷却至室温后进行GC－MS分析。

2 结果与讨论
2.1 色谱行为
全扫描模式（a）和选择离子扫描模式（b）下的总离子流色谱图见图1。

图1 4种类固醇类雌激素的总离子流色谱图Fig.1 TIC chromatograms of 4 steroid estrogens
2.2 衍生化条件的选择
2.2.1 衍生化方法
文献［11－15］采用BSTFA或MSTFA作为类固醇类雌激素（E1、E2、EE2、E3）的衍生化试剂，并通过添加催化剂、加热等方式以提高衍生化效果。

试验考察了6种方法的衍生化效果，结果见表2。

表2 不同衍生化方法下4种类固醇类雌激素的相对衍生化效率Tab.2 Relative derivatization efficiency of 4 steroid estrogens with different strategies of derivatization衍生化方法相对衍生化效果／%E1 E2 EE2 E3（a）加入吡啶50μL
和MSTFA 100μL，涡旋10 s后，于40℃下反应100 min 100.00 100.00
100.00 100.00（b）先加入20 g·L－1甲氧胺盐酸盐吡啶溶液50μL涡旋10 s后，于40℃下反应60 min，氮气吹干后，用50μL吡啶定容；再加入MSTFA 100μL 涡旋10 s后，于40℃下反应40 min 72.27 73.51 72.14 72.90（c）加入MSTFA 100μL涡旋10 s后，于40℃下反应100 min 100.12 95.50 75.07 78.33（d）加入吡啶50μL和BSTFA 100μL涡旋10 s后，于40℃下反应100 min 77.54 83.05 78.22 77.83（e）先加入20 g·L－1甲氧胺盐酸盐吡啶溶液50μL涡旋10 s后，于40℃下反应60 min，氮气吹干后，用50μL吡啶定容；再加入BSTFA 100μL涡旋10 s后，于40℃下反应40 min 71.77 64.28 58.41 55.98（f）加入BSTFA 100μL涡旋10 s后，于40℃下反应100 min 114.23 112.68 77.01 106.11
由表2可知:f方法对E1、E2和E3的衍生化效果均优于其它衍生化方法，但对
EE2的衍生化效果较差。

综合考虑4种类固醇类雌激素的衍生化效果，试验选用a 方法。

2.2.2 衍生化时间及衍生化温度
试验考察了20，40，60，100 min时对衍生效率的影响，结果表明:20 min时的衍生化效果已达到最佳，试验选择衍生化时间为20 min。

试验考察了室温、40℃，45℃，70℃时的衍生效果，结果表明:40℃时的衍生化效果最好，试验选择衍生化温度为40℃。

2.3 固相萃取条件的选择
试验考察了甲醇、乙酸乙酯和丙酮分别作为洗脱剂的洗脱效果，结果发现丙酮作为洗脱剂时，E1、E2、EE2和E3的回收率最大。

试验考察了不同体积（6，8，10，12mL）的丙酮作为洗脱剂的洗脱效果，结果发现洗脱剂体积为10mL时，E1、E2、EE2和E3的回收率最大，再增加洗脱剂用量，
对回收率影响不大。

2.4 标准曲线及检出限
配制E1、E2、EE2和E3的混合标准溶液系列进行测定，每个浓度重复3次，以
色谱峰面积（y）对化合物质量浓度（x，μg·L－1）进行线性回归，得到E1、E2、EE2和E3的线性范围、线性回归方程及相关系数见表3。

以3倍信噪比和10倍信噪比分别计算E1、E2、EE2和E3的检出限和测定下限，结果见表3。

表3 线性参数、检出限和测定下限Tab.3 Linearity parameters，detection limits and the lower limits of determination化合物线性范围ρ／（μg·L－1）线性回归方程相关系数检出限ρ／（μg·L－1）测定下限ρ／（μg·L－1）E1
5.00～500 y＝53.6 x＋1
6.4 0.999 0 1.5 5.0 E2 5.00～500 y＝75.7 x＋24.3
0.999 1 1.5 5.0 EE2 10.0～500 y＝8.97 x＋20.2 0.999 5 3.0 10 E3 10.0～500 y ＝11.9 x＋27.7 0.999 6 3.0 10
2.5 精密度和回收试验
移取500mL不含分析物的去离子水，向其中加入一定量的E1、E2、EE2和E3标准品，充分混匀后，按固相萃取和衍生化处理，重复测定7次，加入10，50，100 ng·L－1混合标准溶液进行加标回收试验，结果见表4。

表4 精密度和回收试验结果Tab.4 Results of tests for precision and recovery
化合物10 ng·L－150 ng·L－1100 ng·L－1回收率／%RSD／%回收率／%RSD／%回收率／%RSD／%E1 88.3 7.9 90.5 7.1 92.5 8.6 E2 91.5 7.3 93.8 8.3 89.7 7.6 EE2 88.6 8.7 87.7 11 90.3 9.3 E3 89.1 7.6 86.8 9.7 92.8 10
由表4可知:样品中E1、E2、EE2和E3的平均回收率在86.8%～93.8%之间，相
对标准偏差在7.1%～11%之间，可满足痕量分析的要求。

2.6 样品分析
按试验方法对某市某污水处理厂的出水进行了检测，结果发现，出水中E1、EE2和E3的含量分别为5.6，12.1，6.3 ng·L－1，E2未检出。

本工作建立了固相萃取－衍生化－气相色谱－质谱法同时测定水中4种类固醇类雌激素的方法，该方法灵敏度高，并且具有良好的线性、准确度和精密度，已成功应用于实际水样的测定。

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