浙液相色谱讲义六：液相色谱的定性、定量分析

用二极管矩阵检测器比较光谱图
苯的色谱及光谱图（Index）
2 8 0 .0 0 2 6 0 .0 0
2 4 0 .0 0
0 .4 0
0 .3 0
0 .2 0
0 .1 0
0 .0 0 0 .4 0 0 .8 0 1 .2 0 1 .6 0 2 .0 0 2 .4 0 2 .8 0
996的纯度角理论
P ro p y lP a ra b e n
0 .6 0
0 .4 0
0 .2 0
0 .0 0 2 .0 0 2 .5 0 3 .0 0 3 .5 0 4 .0 0 4 .5 0 5 .0 0 5 .5 0 6 .0 0
50 40
M in u te s
标准曲线
标 样 峰 面 积 内 标 样 峰 面 积
标准加入法举例

废水样品中五氯苯（PCP）的分析
梯度曲线 梯度曲线
4 ppm 3 ppm 2 ppm
PCP
1 ppm
峰一致性的确认
确认色谱峰的纯度
保证每个色谱峰下只有一个被测的组份 检查是否有共流出的物质（杂质）干扰
色谱峰纯度确认的方法
用光电二极管矩阵检测器比较光谱图 峰纯度鉴定，双波长Ratio 996的纯度角理论
t1
t2
A2
t1
n/2 ml/min t2
溶剂强度、K'及峰高的关系
k' =1.5 k' =1.9
样 品∶15l对二甲氧基苯 色谱柱∶Resolve Silica 溶 剂∶二氯甲烷/戊烷 从85:75到60:45
k' =3.0 k' =4.9
柱效和峰高的关系
如其他因素不变，如：K‘，a，流速等，
准确度的影响因素
标样的可靠性及其配制的准确度 色谱方法的可靠性 色谱泵的精确度（GPC的影响更大） 进样器的准确度，进样技术
流速与检测面积的关系
如在不改变系统效率的情况下，流速降低
峰高几乎不变，然而峰面积与流速相应成 反比增加。
A1
n ml/min t1 t2
A R dt 1 A 1 A 2 2
30 20 10 0 0
50
100 150 样 品 浓 度
200
250
内标法定量（三）
计算公式：
内标样响应值 R ( I . S ) 校正因子∶ RF 标样浓度 C ( X ( X i) i) 标样响应值 R ( X i) 样品峰面积 A i 未知组分的浓度∶ C RF i ( X i) 内标峰面积 A i . s .
检查方法的准确度及精确度
用标样定期检查方法
痕量分析

如信/噪比不够，定量的精确度会受影响，因此要：
分析前浓缩样品 选择高灵敏度检测器 用衍生法

使色谱体系最优化
使用短的微径柱（减少样品的稀释） 使用高效色谱柱 使k'值尽可能小 增加进样体积和浓度 使用低流速（N增加） 采用梯度淋洗
996的纯度角理论可快速得到纯度结果
纯度角
60.00 50.00 40.00
吸光度
角度
30.00 20.00 10.00 0.00
噪声角
不纯物
基线
2.40
2.50
2.60
2.70
时间(分钟)
定量分析的具体内容
确定样品的类型，主要成分/痕量成分 使分析条件的分离度（R）大于：1.5 色谱峰的定性，峰一致性测定 检测限及定量限：确定灵敏度及线性范围 用标样建立标准曲线
3 .5 0
4 .0 0
4 .5 0
5 .0 0
5 .5 0
6 .0 0
6 .5 0
7 .0 0
M in u te s
进一步的确认
标准加入 同时用其他方法
其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色 谱柱） 其他检测器
PDA，光谱图比较、谱库检索 MS，质谱图解析、谱库检索
其他仪器方法
公式： 特点：
A C % i 100 % A i
各组分要全部流出、全部被检测，并对检测 器的响应值一样简单，液相色谱目前很难做 到这点 与进样量无关 不需标样 简单
可收的检测范围
校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围
内有效，高或低于这些点都可能引起计算 错误 问题
线性
液相色谱的定性及定量技术
Waters LC School 培训教材
色谱峰定性
鉴别每个色谱峰
通过比较保留值(通常是保留时间)的方法， 找到各色谱峰所对应的组份 大多数情况下用比较保留时间来定性
即所谓：
保留时间相同，可能是同样的组份 保留时间不同，肯定不是同样的组份
用保留时间定性
用“标样”的保留值定出被测组份的位置
准确度的衡量
色谱方法是相对定量方法，如不考虑损失
及杂质干扰等的因素，其结果同“标样” 的准确程度关系密切 一般的衡量方法是做回收率实验或不同方 法之间的比较：相关系数 相关系数： (X X )( Y Y ) i i
r (X X )( Y Y )
2 i i 2
其中，X及Y分别代表不同方法的实验值及平均值
特点：
无需各组份都被检出、洗脱 需要标样，需要内标样 结果与进样体积无关
内标法定量（四）
对内标物的要求
化学结构与待测组分相似(同系物、异构体) 在样品中不存在 不与样品中组份发生任何化学反应 保留值与待测组分接近 浓度（响应值）与待测组分相当 其色谱峰与其他色谱峰分离好
峰面积百分比法定量
M in u t e s
M in u t e s
M in u t e s
5,000 4,000
响应值 ( 峰面积)
3,000 2,000 1,000 0
标准曲线
0
50
100 150 样品浓度
200
250
外标法定量（三）
计算公式
标样浓度 C (X i) 校正因子∶ RF (X i) 标样响应值 R (X i)
液相色谱定量的精度

测量的精度
好的精度
不好的精度
定量的准确度

误差∶
E = O - T
O∶观测到的值
T∶真值
液相色谱定量精度的计算

测量精度的计算
Xi 平均值∶ X N 标准偏差∶ 变异系数∶ 2 ( X X ) i N 1
CV % (100 ) X
0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 5 0 1 . 0 0 1 . 5 0 2 . 0 0 2 . 5 0 3 . 0 0 3 . 5 0 4 . 0 0 4 . 5 0 5 . 0 0 5 . 5 0 6 . 0 0 6 . 5 0 7 . 0 0
0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 5 0 1 .0 0 1 . 5 0 2 . 0 0 2 . 5 0 3 . 0 0 3 . 5 0 4 . 0 0 4 . 5 0 5 . 0 0 5 . 5 0 6 . 0 0 6 . 5 0 7 . 0 0
未知组分的浓度∶ C 样品响应值 A i RF (X i i)
特点
无需各组份都被检出、洗脱 需要标样 标样及样品测定的条件要一致 进样体积要准确
进样技术对定量结果的影响
固定体积定量管（loop）的进样器精度最好，其 准确度取决于进样器的结构 可变体积进样器的精度取决于操作者的技术，准 确度通常更高，因为进样用的注射器结构的准确 度高，操作者的技术水平也有影响，但不大 WISP 自动进样器精确度及准确度都可达到定量 管进样器的水平，因为其每一微升分27步以上。 然而它又保留了可变体积进样器的优点
0 .3 0
0 . 3 0
0 . 3 0
0 .2 5
0 . 2 5
0 . 2 5
0 .2 0
0 . 2 0
0 . 2 0
0 .1 5
0 . 1 5
0 . 1 5
0 .1 0
0 . 1 0
0 . 1 0
0 .0 5
0 . 0 5
0 . 0 5
0 .0 0 0 .0 0 0 . 5 0 1 . 0 0 1 . 5 0 2 . 0 0 2 . 5 0 3 . 0 0 3 . 5 0 4 .0 0 4 . 5 0 5 .0 0 5 . 5 0 6 . 0 0 6 . 5 0 7 . 0 0
0 .4 0 0 .3 5
E th y lp a r a b e n
0 .3 0
P r o p y lp a r a b e n
0 .2 5
AU
0 .2 0
U r a c il
0 .1 5
0 .1 0
0 .0 5
0 .0 0 0 .0 0
0 .5 0
1 .0 0
1 .5 0
2 .0 0
2 .5 0
3 .0 0

内标法定量（一）
配制一系列浓度的标样，其中加有内标样
内标法定量（二）
实际色谱图
v o lts
0 .8 0 1 .8 0
M e th y lP a ra b e n
1 .6 0
1 .4 0
E th y lP a ra b e n B u ty lP a ra b e n
1 .2 0
1 .0 0
柱效增加峰面积基本不变，而峰高增加。
6 1
4
2 3
2
1 .0
1 .1
1 .2
常用的定量方法
峰面积百分比法
由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用
外标法
在液相色谱中用的最多
内标法
准确，但是麻烦 在标准方法中用的最多
外标法定量
配制一系列已知浓度的标样
外标法定量（二）
实际色谱图
围 范 测 检 的 望 所希
题 问 度 灵敏
最低浓度标样
检测器响应
最高浓度标样
样品浓度
定量校正曲线

曲线A：
因在零浓度时仍有色谱峰， 可能有杂质未分开
B C A D

曲线B：
在此浓度内，检测器的响应 值是非线性的

曲线C：
可接受的理想状态，实际情 况应是∶其延长线到零点

曲线D：
表明有样品的损失，可能是色谱柱的非特征吸附，也 可能是 样品制备时的损失