免疫PCR技术检测肠出血型大肠埃希菌O157:H7

免疫PCR技术检测肠出血型大肠埃希菌O157：H7
赵春燕;曹娜娜;王海河;梁松鹤
【摘要】目的通过检测肠出血型大肠埃希菌O157:H7菌株,确定免疫PCR技术的检测灵敏度和特异性,探讨该方法用于检测食品和临床标本的可行性.方法免疫PCR 技术检测O157:H7标准菌株和自食品、临床标本分离的菌株.结果免疫PCR最少可检测101/ml O157:H7细菌,临床和食品分离的O157:H7茵株检测结果均为阳性,而非O157:H7菌株检测结果均为阴性.结论免疫PCR技术具有较高的检测灵敏度、特异性及操作简便等特点,可作为食品和临床标本检测O157:H7方法.
【期刊名称】《临床检验杂志》
【年(卷),期】2010(028)005
【总页数】2页(P332-333)
【关键词】大肠埃希菌;检测;O157:H7;免疫PCR
【作者】赵春燕;曹娜娜;王海河;梁松鹤
【作者单位】吉林大学白求恩医学院病原生物学教研室,长春,130021;吉林大学白求恩医学院病原生物学教研室,长春,130021;哈尔滨医科大学大庆校区,病原生物学教研室,黑龙江大庆,163319;哈尔滨医科大学大庆校区,临床检验教研室,黑龙江大庆,163319
【正文语种】中文
【中图分类】Q93-3
肠出血型大肠埃希菌(EHEC)是一群能引起人类出血性肠炎的病原菌，O157：H7是EHEC的主要血清型[1]。

本研究以链亲合素连接生物素化的二抗和双链DNA 指示分子，构建桥联系统，建立免疫PCR技术，并对O157:H7菌株和自临床标本、食品分离的菌株进行检测，分析该方法的检测灵敏度和特异性，探讨该法用于检测食品和临床标本的可行性。

1 材料与方法
1.1 标本来源收集2007年9月～2008年5月自生牛肉、牛奶、牛粪便及吉林大学第一临床医院腹泻患者粪便标本分离的13株O157:H7菌株，按《全国临床检验操作规程》的培养及生化反应法鉴定。

E.coli O157:H7、O26:H11、O5:NM及志贺毒素阴性E.coli ATCC 23716等菌株由本实验室保存。

1.2 标本处理将待检菌株接种于血琼脂平板，37 ℃培养过夜，挑取单个菌落混悬于生理盐水并以盐水离心洗涤3次，沉淀物悬于2 ml包被缓冲液(0.05 mol/L PBS，pH 9.6)，用于定量分析的O157:H7菌液经标准比浊管配制成108/ml，再用包被缓冲液连续10倍稀释，超声(功率为7 W)裂解30 s。

1.3 生物素化DNA(指示DNA)制备用DNA提取、纯化试剂盒(大连联星公司)提取C57BL/6J小鼠(吉林大学白求恩医学院动物室提供)基因组，依据GAPDH基因645～801核苷酸序列设计引物，引物1，5′-TCACTGCCACCCAGAAGACT-3′；引物2，5′-biotinAAGGCCATGCCAGTGAGC-3′(上海生工公司合成)，扩增产物长度157 bp。

将此生物素化DNA作为指示DNA。

反应体系50 μl，包括：
10×buffer 5 μl,25 mmol/L MgCl2 3 μl,2.5 mmol/L dNTP 4 μl，引物1、2(10 μmol/L)各1 μl,Taq DNA 聚合酶0.6 μl,模板10 μl，重蒸馏水(DDW)25.4 μl。

反应程序：95 ℃预变性5 min,95 ℃ 1 min,55 ℃、72 ℃ 1 min,30个循环后72 ℃延伸10 min。

制成的指示DNA片段,-20 ℃保存备用。

1.4 免疫PCR反应按参考文献[1]将浓度为108～10-3/ml系列稀释的菌液加入ELISA反应板中，每孔100 μl,4 ℃包被过夜；加入含20 g/L BSA-PBS(Sigma公司)每孔150 μl，37 ℃封闭1 h，PBST洗4次后加入兔抗O157:H7菌体抗原血
清(北京鼎国公司)每孔100 μl，37 ℃温育1 h；PBST洗涤后加入生物素化的羊抗兔IgG(宝泰克公司)每孔100 μl，37 ℃反应1 h；PBST洗4次后加入100 ng/ml 链亲合素(Roche公司)每孔100 μl，室温200 r/min震荡30 min；PBST洗4次加1 ng/ml生物素化DNA(指示DNA)每孔50 μl，室温200 r/min震荡30 min,PBST洗涤4次，再用DDW洗涤4次，最后加入50 μl DDW，置分子杂交
炉中96 ℃加热5 min。

取10 μl上清液移入PCR管中扩增，并设阴性对照。

反应体系和循环参数与制备生物素化DNA相同。

产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫
外凝胶成像系统观察结果并照相保存。

1.5 免疫PCR灵敏度分析将实验室保存的大肠埃希菌O157:H7和临床分离菌的108～10-3/ml悬液用于免疫PCR灵敏度测定。

1.6 免疫PCR特异性分析对3株实验室保存的E.coli O157:H7、O26:H11、
O5:NM、ATCC 23716、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、乙型链球菌行检测，同时对13株分离菌进行检测，评价免疫PCR的特异性。

2 结果
2.1 免疫PCR灵敏度当菌液浓度为101/ml 时，免疫PCR仍可扩增出157 bp的指示DNA片段，因此免疫PCR法最低可检测到101/ml细菌(图1)。

注：1，DNA marker;2～12,O157:H7菌株108/ml～10-3/ml；13，盐水阴性对照；14，PCR阴性对照。

图1 免疫PCR检测E.coli O157:H7的灵敏度
2.2 免疫PCR特异性分析 3株本室保存的E.coli O157:H7检测结果均为阳性，而
E.coli O26:H11、O5:NM、ATCC 23716、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、肺炎链
球菌、铜绿假单胞菌、乙型链球菌检测结果均为阴性(图2)。

注：1，DNA marker;2,E.coli O157：H7(来自牛奶);3,E.coli O26:H11;4,E.coli
O5:NM;5,E.coli ATCC 23716;6,E.coli O157：H7(来自牛粪便);7,金黄色葡萄球菌; 8,变形杆菌;9,肺炎链球菌;10,E.coli O157：H7(来自羊粪便);11,铜绿假单胞菌; 12,乙型链球菌;13,盐水阴性对照;14,PCR阴性对照。

图2 免疫PCR检测E.coli
O157:H7的特异性
2.3 检测食品和临床标本中分离的O157:H7 用免疫PCR技术对13株食品和临床标本分离的E.coli O157:H7进行检测，结果均为阳性(图3)。

注：1，DNA marker;2～14,从食品和临床标本中分离的O157:H7菌株；15，生理盐水对照；16，PCR阴性对照。

图3 检测食品和临床标本中的E.coli O157:H7 3 讨论
免疫PCR技术是Sano[2]等在1992年首创的一种新型检测技术，它综合了固相
免疫反应和 PCR的优势,灵敏度和特异性较高。

免疫 PCR 中所用的抗原或抗体标
记物为DNA,在固相免疫反应完成后,用PCR 技术对标记 DNA 扩增,通过检测PCR 产物对抗原或抗体进行定性或定量分析。

由于以PCR扩增代替ELISA的酶催化底物显色，因此灵敏度比ELISA提高了101～104倍[3]。

免疫PCR对载体的选择非常重要,本试验选用聚氯乙烯微孔板，包被前紫外线照射2 h使载体表面带正电荷，可增强吸附抗原能力，也利于洗板操作。

免疫PCR技术的关键是桥联系统的建立。

本实验借鉴Hong等[4]的研究，克服了嵌合蛋白非特异结合以及生物素化抗体-亲合素-生物素化 DNA 系统预结合复合物不均一的问题,提高了试验的准确性和可重复性。

该系统中指示分子来源于小鼠GAPDH基因，为双链DNA 片段，可增加标记物的稳定性；双链 DNA 中未与抗体结合的链，在 PCR 的第一个循环变性阶段即可从抗体上脱离,消除了变性抗体对PCR 扩增的空间位阻作用，增强了PCR扩增效果，且该指示分子与待检样品中的DNA分子不具有同源性，增强了检测的特异性。

本试验通过免疫PCR技术检测了食品和临床标本中的大肠埃希菌O157:H7,其灵敏度可以达到101/ml，且与其他大肠埃希菌及其他菌属间无非特异性反应，具有较高的检测特异性。

4 参考文献
[1]Karch H, Tarr PI, Bielaszewska M. Enterohaemorrhagic Escherichia coli in human medicine [J]. Int J Med Microbiol, 2005, 295(6-7):405-418.
[2]Sano T, Smith CL, Cantor CR, et al. Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates[J]. Science, 1992, 258(5079): 120-122.
[3]Niemeyer CM, Adler M, Wacker R, et al. Immuno-PCR: high sensitivity detection of proteins by nucleic acid amplification[J]. Trends Biotechnol, 2005, 23(4): 208-216.
[4]Hong Z, Robert JF,Taki SP. Universal immuno-PCR for ultra-sensitive target protein detection [J]. Nucleic Acids Res,1993,21(25): 6038-6039.。