大豆皂苷对D—半乳糖胺及内毒素所致小鼠急性肝损伤的保护作用

大豆皂苷对D—半乳糖胺及内毒素所致小鼠急性肝损伤的保护作用目的：研究大豆皂苷对D-半乳糖胺（GalN）及内毒素（LPS）联合诱发的
急性肝损伤的保护作用。

方法：将实验小鼠按体重随机分为5组，即正常组、模型组、阳性对照水飞蓟素组（0.10 mmol·kg-1）及大豆皂苷高、低剂量组（0.24，0.12 mmol·kg-1）。

每日给药1次，连续7 d。

实验末期，除正常组外，其余组小鼠腹腔注射GalN和LPS建立急性肝损伤模型，苏木素-伊红（HE）染色法观察肝组织病理学变化，ELISA法检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α），比色法检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）以及肝脏过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）活性及还原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）含量和Caspase-3，Caspase-8活化水平。

结果：大豆皂苷明显降低GalN和LPS联合诱导的急性肝损伤小鼠血清ALT，AST活性，减轻肝组织病理损伤，降低血清TNF-α水平，降低肝NO和MDA水平，升高肝组织CAT，GPx，GST活性和GSH水平，降低肝组织Caspase-3和Caspase-8活化水平。

结论：大豆皂苷对GalN和LPS联合诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用，其机制可能与其抗氧化活性和抗肝细胞凋亡作用有关。

标签：大豆皂苷；肝损伤；抗氧化；凋亡
流行病学调查证实，常食大豆有助于预防癌症和心血管疾病的发生，而这些均与大豆中的异黄酮和皂苷等活性物质密切相关。

大豆皂苷是存在于大豆中的一类五环三萜的糖苷，主要分为A类、B类、E类和DDMP皂苷[1]。

具有抗氧化、抗癌、防治心血管疾病及免疫增强等多种药理作用[2-3]。

研究还表明，大豆皂苷对酒精性肝损伤以及半刀豆球蛋白A所致免疫性肝损伤具有保护作用[4-5]。

本实验通过建立D-半乳糖胺（GalN）及内毒素（LPS）联合诱导的小鼠急性肝损伤模型，观察大豆皂苷对小鼠急性肝损伤的保护作用，为大豆皂苷的开发利用提供科学依据。

1 材料
1.1 动物昆明小鼠，雄性，体重18～22 g，由延边大学实验动物中心提供。

1.2 药物和试剂大豆皂苷（纯度≥80%）购于华北制药股份有限公司；GalN 及LPS购于Sigma公司；水飞蓟素购于沈阳东陵药业股份有限公司；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、还原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）及蛋白试剂盒购于南京建成科技有限公司；TNF-α ELISA试剂盒购于武汉博士德公司。

1.3 仪器3-30K型离心机（德国Sigma公司）；S22PC型分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；RT-2100型酶标仪（深圳雷杜公司）；ZMN-7803型组织包埋机（常州市华利电子有限责任公司）；RM2126型切片机（上海徕卡仪器有限公司）；BA200型生物显微镜（中国麦克奥迪实业集团有限公司）。

2 方法
2.1 动物分组及处理将50只小鼠按体重随机分为5组，即正常组、模型组、水飞蓟素组（0.10 mmol·kg-1）、大豆皂苷高、低剂量组（0.24，0.12 mmol·kg-1）。

每日灌胃给药1次，连续7 d，正常组及模型组小鼠则以等体积生理盐水灌胃。

末次给药1 h后，除正常组腹腔注射无菌生理盐水外，其余各组小鼠腹腔注射给予2.26 mmol·kg-1 GalN和10 μg·kg-1 LPS（用无菌生理盐水配制）。

造模期间禁食，不禁水。

2.2 血清转氨酶及TNF-α水平的检测造模1.5 h后，分离血清，检测小鼠血清TNF-α。

造模8 h后，分离血清，检测小鼠血清ALT，AST活性，并按公式计算药物对TNF-α及转氨酶活性的抑制率。

抑制率= （模型组-治疗组）/（模型组-正常组）×100%
2.3 肝组织病理学检查造模8 h后处死动物，取小鼠肝左叶，固定于10%福尔马林溶液中，常规石蜡包埋、切片、HE染色，在光镜下观察肝组织病理学变化。

2.4 肝组织氧化应激、抗氧化活力及凋亡相关指标的检测4 ℃裂解肝细胞，离心取上清。

按照各测试盒操作方法测定CAT，GPx，GST，GSH，MDA，NO 水平以及肝细胞Caspase-3和Caspase-8活性的相对活化程度。

2.5 统计学处理数据以±s表示，组间均数比较采用SPSS 11.5统计软件，进行单因素方差分析和Turkey’s多因素t检验。

3 结果
3.1 大豆皂苷对急性肝损伤小鼠血清ALT和AST活性的影响与正常组比较，模型组小鼠血清ALT和AST活性明显升高（P＜0.05），表明小鼠急性肝损伤模型制备成功。

与模型组比较，大豆皂苷高、低剂量组小鼠血清ALT，AST 活性明显降低（P＜0.05），提示大豆皂苷对GalN/LPS所致肝损伤具有保护作用。

大豆皂苷低剂量组对血清ALT，AST的抑制率分别为42%，43%，接近或超过水飞蓟素组的50%，37%，说明其保肝活性稍弱于水飞蓟素，见表1。

3.2 大豆皂苷对急性肝损伤小鼠肝组织病理学的影响注射GalN/LPS后，模型组小鼠肝小叶结构模糊，肝细胞索排列紊乱，可见灶状肝细胞坏死，伴有炎细胞浸润。

肝细胞核明显大小不等，呈不同程度的固缩，凋亡严重。

与模型组比较，大豆皂苷和水飞蓟素干预均能减轻上述肝组织病理学损伤，大部分肝细胞结构完整，排列整齐，偶尔有凋亡细胞，见图1。

3.3 大豆皂苷对急性肝损伤小鼠血清TNF-α以及肝NO水平的影响与正常组比较，模型组小鼠血清TNF-α和肝NO 水平明显升高（P＜0.05）；而大豆皂苷高、低剂量组小鼠血清TNF-α和肝NO水平与模型组比较明显降低（P＜0.05）。

大豆皂苷高剂量组小鼠对血清TNF-α和肝
NO含量的抑制率分别为56%，86%，接近或超过水飞蓟素组小鼠的51%，78%，见表2。

3.4 大豆皂苷对急性肝损伤小鼠肝组织抗氧化活力和脂质过氧化水平的影响注射GalN和LPS明显降低模型组小鼠肝匀浆CAT，GPx和GSH水平（P＜0.05），增高肝匀浆MDA含量（P＜0.05）。

说明GalN/LPS所致的急性肝损伤降低小鼠肝脏抗氧化防御能力，引起典型脂质过氧化损伤。

大豆皂苷治疗可回升小鼠肝匀浆CAT，GPx活性和GSH含量（P＜0.05），降低肝匀浆MDA水平。

与正常组比较，模型组小鼠肝组织GST水平没有显著性变化，但大豆皂苷高剂量和水飞蓟素干预则可明显增高小鼠肝组织GST活性（P＜0.05），见表3。

3.5 大豆皂苷对急性肝损伤小鼠肝Caspase-3和Caspase-8活化的影响GalN/LPS可明显升高模型组小鼠肝细胞Caspase-3和Caspase-8相对活性（P＜0.05），而大豆皂苷可降低急性肝损伤小鼠肝Caspase-3和Caspase-8相对活性（P ＜0.05），见表4。

4 讨论
GalN/LPS诱导的肝损伤小鼠是研究急性肝损伤十分理想的动物模型。

GalN 诱发的动物肝组织损伤在形态学和功能学上与人类急性重症肝炎相似，而小剂量LPS可诱导GalN致敏小鼠发生急性肝功能衰竭[6]。

本实验结果表明，大豆皂苷可明显降低GalN/LPS所致急性肝损伤小鼠血清ALT和AST活性，提示大豆皂苷可减轻GalN/LPS诱导的肝细胞损伤和改善肝脏功能状况。

免疫性肝损伤的原理是单核细胞或巨噬细胞在致炎因子的作用下，向肝脏积聚并致敏，致敏的巨噬细胞接触到LPS后，会释放一些炎性介质如自由基和TNF-α等，继而诱发炎症反应并造成肝细胞损伤[7]。

血清TNF-α在炎性反应的发生、发展过程中发挥关键作用[8]。

在炎症反应中，NO大量释放也被人们关注和广泛研究[9]。

NO是一种细胞信使分子和细胞毒性分子，对肝细胞具有毒性效应，是组织损伤的诱发因子和各种病变的增强因子，能引起肝损伤。

NO的这种双重性在肝脏疾病的发生与治疗中具有重要作用[10]。

本实验结果表明，GalN/LPS处理可增高肝损伤小鼠血清TNF-α和肝NO水平，而大豆皂苷预处理可降低血清TNF-α和肝NO水平，从而减少炎症反应的发生。

活性氧自由基引发的氧化应激是肝病发病的共同病理生理基础，因此，对氧化应激导致肝细胞损伤的研究便成为治疗肝脏疾病的一个重要途径[9-10]。

CAT，GPx和GST是体内重要的抗氧化酶和解毒酶，可与GSH等抗氧化剂一起能有效清除体内脂质过氧化物，使机体免受自由基的损害[9-10]。

本实验表明，模型组小鼠肝脏脂质过氧化水平升高，抗氧化酶活性及GSH水平降低。

而大豆皂苷预处理可逆转这些血清及肝脏指标，提示大豆皂苷可提高抗氧化防御能力和抑制脂质过氧化反应，这可能是大豆皂苷保护肝损伤的重要机制之一。

细胞凋亡是LPS诱导GalN致敏小鼠最重要的肝细胞死亡形式[11-12]。

而胱天蛋白酶的级联反应是推动细胞凋亡程序的核心事件。

在细胞凋亡的效应阶段，
最重要的是发生Caspase活化，Caspase活化直接或间接引起细胞凋亡结构特征的出现[11-12]。

本实验结果显示，GalN和LPS能诱导肝组织Caspase-3和Caspase-8活性增高，而大豆皂苷明显降低肝组织Caspase-3和Caspase-8活性，提示大豆皂苷可抑制急性肝损伤小鼠肝细胞凋亡。

综上所述，大豆皂苷对GalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用，其机制可能与其减少炎症反应、提高抗氧化活性以及抑制肝细胞凋亡作用有关。

该研究结果对大豆皂苷在保肝方面的开发利用具有一定的参考价值。

[参考文献]
[1] 孙权，刘淑萍，金爱花，等. 大豆皂甙体外抗氧化活性研究[J]. 食品科技，2010，35（3）：72.
[2] 裴迎新，赵焕焕，杜晓燕，等. 大豆皂甙Bb对食管癌细胞凋亡的影响及其机制研究[J]. 卫生研究，2010，39（4）：444.
[3] Rodrigues H G，Diniz Y S，Faine L A，et al. Antioxidant effect of saponin：potential action of a soybean flavonoid on glucose tolerance and risk factors for atherosclerosis [J]. Int J Food Sci Nutr，2005，56（2）：79.
[4] Sasaki K，Minowa N，Kuzuhara H，et al. Preventive effects of soyasapogenol B derivatives on liver injury in a concanavalin A-induced hepatitis model [J]. Bioorg Med Chem，2005，13（16）：4900.
[5] 杨修仕. 大豆皂苷对急性酒精性肝损伤的保护作用研究[D]. 太原：山西大学，2011.
[6] 宋志伟，吴艳玲，朴惠善. 桦褐孔菌对小鼠急性肝组织损伤的保护作用[J]. 延边大学医学学报，2007，30（1）：34.[7] 邓秀兰，钟相根，张晓晶，等. 痰热清注射液对小鼠免疫性肝损伤的防护作用[J]. 中国中药杂志，2011，36（5）：636.
[8] 郭宏兴，刘亮明，张吉翔，等. 大鼠内毒素性急性肝损伤后肝细胞凋亡与炎性因子的表达[J]. 中华传染病杂志，2008，26（7）：415.
[9] 周燕，翟羽佳，何蓉蓉，等. 荆条子乙醇提取物对小鼠免疫性肝炎及急性炎症的影响[J]. 中国中药杂志，2011，36（17）：2404.
[10] 宋军，赵军宁，王晓东，等. 芍甘多苷对四氯化碳亚急性肝损伤大鼠肝细胞线粒体保护作用[J]. 中国中药杂志，2011，36（7）：931.
[11] Liu D，Li C，Chen Y，et al. Nuclear import of proinflammatory transcription factors is required for massive liver apoptosis induced by bacterial lipopolysaccharide [J]. J Biol Chem，2004，279：48434.
[12] 朴龙，杨振凯，杨阳，等. 草苁蓉环烯醚萜对内毒素诱导D-半乳糖胺致敏小鼠肝细胞凋亡的影响[J]. 前沿科学，2011，5（2）：11.
Protective effect of soyasaponins on acute liver injury induced by
D-galactosamine and lipopolysaccharide in mice
XU Hui-xian1，ZHAO Wen-xi2，QUAN Ji-shu2，YIN Xue-zhe1*
（1. Affiliated Hospital of Yanbian University，Yanji 133000，China； 2. Medical College of Yanbian University，Yanji 133002，China）
[Abstract] Objective：To investigate the protective effect of soyasaponins on acute liver injury induced by D-galactosamine （GalN）and lipopolysaccharide （LPS）in mice. Method：The mice were randomly divided into five groups：the normal control，the model group，the silymarin （positive control）group，and soyasaponins high and low-dose groups. They were administered with drugs once every day for 7 days. At the end of the experiment，GalN and LPS were injected intraperitoneally to all of the groups except for the normal group to establish the acute liver injury model. The pathological changes were detected with hematoxylin & eosin （HE）staining，tumor necrosis factor-α （TNF-α）was detected by ELISA method，and the alanine aminotransferase （ALT），aspartate aminotransferase （AST），catalase （CAT），glutathione peroxidase （GPx），glutathione S-transferase （GST），reduced glutathione （GSH），malondialdehyde （MDA），nitric oxide （NO），and the activation of Caspase-3 and Caspase-8 were detected by the colorimetric method. Result：Soyasaponins could reduce the activities of serum ALT and AST，the acute hepatic injury induced by GalN/LPS，serum TNF-α level，hepatic NO and MDA contents，and the Caspase-3 and Caspase-8 activations of liver tissues，and increase the hepatic CAT，GPx，GST and GSH levels. Conclusion：Soyasaponins shows the protective effect on acute liver injury induced by GalN and LPS in mice，which may be related to its antioxidative ability and anti-liver apoptosis.
[Key words] soyasaponins；liver injury；anti-oxidation；apoptosis
doi：10.4268/cjcmm20131330。