ISSR分子标记技术及其在园艺作物中的应用

收稿日期:20061113基金项目:广西 新世纪十百千人才工程 专项(2003211);广西青年科学基金项目(桂科青0447015);广西农科院科技发展基金项目(2003006(Z ))
作者简介:王绪(1980) 女 河北保定人 在读硕士 研究方向为蔬菜遗传育种与生物技术0%为通讯作者0
ISSR 分子标记技术及其在园艺作物中的应用
王
绪1 邓俭英2
方锋学2%
(1.广西大学农学院
南宁
530005;
2.广西农科院蔬菜研究中心
南宁
530007)
摘要:ISSR 是一种基于微卫星序列发展起来的新的分子标记 具有简便迅速~稳定高效~DNA 多态性高等优点0ISSR 标记呈孟德尔式遗传 大部分ISSR 标记为显性标记0ISSR 技术的基本原理是在SSR 的3 或5 端加锚1~4个嘌呤或嘧啶碱基 引起特定位点退火 使引物与匹配SSR 的一端结合 从而对基因组中特定片段进行扩增~检测 最后根据谱带的有无及相对位置分析不同样品间ISSR 标记的多态性0目前ISSR 分子标记技术在园艺作物的遗传多样性研究~遗传图谱构建~基因定位~分子标记辅助育种及品种纯度鉴定方面得到了广泛应用 但ISSR 技术在解决交配系统~计算杂合度与父系分析等问题上效果不佳 今后仍需结合研究目的选择适宜的分子标记进行研究 以提高分子标记的选择效率0
关键词:ISSR ;园艺作物;应用中图分类号:S 603.2
文献标识码:A
文章编号:1002 8161(2007)04-0371-04
ISSR molecular marker technigue and its application in horticultural crops
WANG Xu 1 DENG Jian -ying 2 FANG Feng -xue
2%
(1.Aglzcultule college Guangxz unzuelszty Nannzng 530005 chzna ; 2.Vegetable resealch centle
Guangxz Academy of Aglzcultulal S czences Nannzng 530007 chzna )
Ab stract :In t e r -S i mpl e S e g uen c e r e p ea t (ISSR )i S a ne W mol e c u l a r m a rk e r m e thod b a S e d o n m i cro -S a t e ll i t e t e ch ni g ue W i th a dv an t age S of S i mpl e g ui ck St a bl e r e l ia bl e an d h ig h e r DNA pol y morph i Sm e tc .ISSR m a rk e rS a r e in h e r i t e d in M en d e l ian mod e l an d moSt of th e m a r e dom inan t m a rk e rS .Th e b a S i c pr in c i pl e of ISSR t e ch ni g ue i S a S folloW e d :1-4p u r ine b a S e S or p y r i m i d ine b a S e S to b e a dd e d in 3 or 5 en d of SSR to in d u c e th e Sp e c ia l S i t e an-nea l ing an d m a k e th e pr i m e S comb ine W i th o ne en d of m a tch ing SSR th en th e Sp e c i f i c fr ag m en tS of gen om e a r e a m -pl i f ie d an d d e t e ct e d an d th e pol y morph i Sm of ISSR m a rk e r a mo ng d i ff e r en t S a mpl e S i S ana l y Z e d a ccord ing to b eing W i th or W i tho u t b an d an d i tS r e l a t i v e loc a t i o n .A t pr e S en t ISSR h a S b een W i d e l y a ppl ie d in gene t i c d i v e rS i t y r e-S ea rch gene t i c m a p co n Str u ct i o n gene t i c m a pp ing mol e c u l a r m a rk e r -a SS i St e d br ee d ing an d v a r ie t y p u r i t y i d en t i f i-c a t i o n of hort i c u lt u r a l cropS .B u t th e ISSR t e ch ni g ue h a S n o b e tt e r e ff e ctS o n r e Solv ing th e m a t ing S y St e m c a lc u-l a t ing h e t e roZ yg oS i S an d p a trol inea l ana l y S i S an d So o n .In th e f u t u r e S ui t a bl e mol e c u l a r m a rk e rS Wo u ld b e S e l e ct -e d a ccord ing to in t en t i o n of St u d y to en h an c e th e S e l e ct i o n e ff i c ien t of mol e c u l a r m a rk e rS .
K e y w ords :ISSR ;hort i c u lt u r e cropS ;a ppl i c a t i o n
遗传标记指受基因控制~能够稳定遗传的且能代表个体或群体的遗传特征 并可被用作遗传分析的物质0遗传标记经历了形态学标记~细胞学标记~生化标记和分子标记4个阶段[1]0形态标记指植物的外部特征 细胞标记主要是染色体的核型和带型 生化标记主要包括同工酶和贮藏蛋白0这3种标记
都是基因表达的结果 是对基因的间接反映 其可利用的多态位点较少 多态性较差 易受环境条件的影响0分子标记是以生物大分子物质 尤其是生物体的遗传物质 核酸的多态性为基础的遗传标记 它的本质是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征DNA 片段[2]0
-
173-广西农业科学
2007年第38卷第4期
由于DNA分子标记相对于传统的遗传标记具有理论上标记数目无限~不受环境因素的影响~可在整个基因组范围内搜索数量性状基因座(guantita-
tive trait lOci GTL)从而可用于研究数量性状遗传规律等优点使它的应用越来越广泛G主要涉及分子遗传图谱的构建~重要基因的标记与定位~基因的图位克隆~生物种质资源的研究~比较基因组研究及物种进化关系的研究等领域[3]G到目前为止已有几十种技术可用于分子标记的筛选本文主要介绍了ISSR分子标记技术的基本原理及其在园艺作物中的应用G
1ISSR分子标记的基本原理和特点
ISSR(inter simple seguence repeat)即简单重复间序列标记[4]是从微卫星发展而来的分子标记
技术G微卫星也称为简单序列重复(simple seguence repeats SSR)或短串连重复(shOrt tandem repeats
STR)[5 6]G微卫星是指以少数几个核苷酸(1~5个)为单位多次串联重复的DNA序列分布于常染色质区是真核生物基因组重复序列的主要组成部分均匀分布于基因组中G
ISSR技术的基本原理就是在SSR的3或5端加锚1~4个嘌呤或嘧啶碱基G基因组中SSR一般为2~6个寡聚核苷酸用于ISSR的引物常为5'或3'端加锚的二核苷酸~三核苷酸~四核苷酸重复序列重复次数(n)一般为4~8次使引物的总长度达到16~18bp G对两侧具有反向排列SSR的一段DNA 序列进行扩增从而保证ISSR引物能够对SSR之间的DNA序列进行PCR扩增[7~9]G5'或3'端用于锚定的碱基数目一般为1~4个锚定的目的是引起特定位点退火使引物与匹配SSR的一端结合从而对基因组中特定片段进行扩增~检测最后根据谱带的有无及相对位置来分析不同样品间ISSR标记的多态性G
ISSR标记继承了PCR的优点具有技术简单~检测迅速~灵敏度高~特异性强~检测容易的特点G由于微卫星在基因组中广泛分布[10]且等位变异特别丰富因而ISSR可以检测到高的多态性;另外IS-SR不像SSR PCR具有物种特异性它可以和RAPD一样用于各类动植物的研究只是引物设计要求不同但其产物多态性远比RFLP~SSR~RAPD 更加丰富可以提供更多的关于基因组的信息而且比RAPD技术更加稳定可靠实验重复性更好[11];ISSR为显性标记符合孟德尔遗传规律并且无需克隆~制备探针~分子杂交等工作具有简便迅速~高效~实验成本低等优点G然而ISSR标记也有不足其不足之处在于,PCR扩增反应的最适条件需要一定时间的摸索;ISSR标记大多是显性标记在解决交配系统~计算杂合度与父系分析等问题时效果不佳[12]G
2ISSR分子标记技术在园艺作物中的应用
2.1遗传多样性研究
对不同品种精确的系统学区分是种质资源保护和品种改良的基础G传统的作物分类方法主要是形态标记分类法具有较大的不可靠性许多品种之间的分类关系及亲缘关系仍需进一步研究G分子标记的出现大大弥补了传统形态标记分类法的不足成为现代作物分类学研究的有力工具G
刘万勃等利用RAPD和ISSR分子标记技术对
37份甜瓜种质进行了遗传多样性研究将供试材料分为野生甜瓜和栽培甜瓜两大类群其中栽培甜瓜又分为厚皮甜瓜和薄皮甜瓜两大亚群[13]G
EiadthOng等对13个泰国芒果品种的ISSR分析表明其中2个和其他品种关系较远而另外11个品种可分为3个类群[14]G Lanham等对醋栗的ISSR分析表明醋栗次级基因库遗传变异丰富可运用于早期育种计划[15]G MOrenO等用12个ISSR引物~2种电泳方法均不能从葡萄品种Garnacha12个变异单株中检测到多态性尽管这些试材来源不同说明这些单株尽管表型发生变化其基因本质并未发生很明显的分化[4]G杨若林用筛选到的12个ISSR引物对我国11个辣椒农家品种进行扩增结果共扩增出66条带其中差异条带26条多态条带比率(PPB)为39.39%;品种特异条带7条占总条带数的10.61%G基于Jaccard遗传相似性系数的NeighbOr-JOining聚类分析可以将11个辣椒品种分为两组每组所含辣椒品种与聚类分析的结果相同[16]G
2.2遗传图谱的构建
遗传图谱(genetic map)是指以染色体重组交换率为相对长度单位以遗传标记为主体构成的染色体线状连锁图谱G通过构建遗传图谱可为基因定位与克隆及基因组结构和功能的研究打下基础G传统的遗传标记技术标记数目少难以形成较完整的连锁图G目前已构建了番茄~马铃薯~辣椒~莴苣~甘
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蓝~胡萝卜~芥菜~豌豆~黄瓜~白菜~芹菜等约20种蔬菜作物遗传图谱其中番茄~马铃薯~甘蓝等的图谱已趋于饱和,张仁兵等用西瓜的重组自交系构建了遗传图谱此图谱包括87个RAPD标记13个IS-
SR标记和4个SCAR标记15个连锁群[17],易克等利用可溶性固形物含量高~皮薄~感枯萎病的栽培西瓜自交系97103 及可溶性固形物含量低~皮厚~抗病的野生西瓜种质PI296341为亲本获得了重组自交系群体建立了由38个SSR标记和10个ISSR标记组成的分子图谱该图谱总长558.1cM平均图距为11.9cM[18],
2.3基因定位
在蔬菜作物中许多重要的农艺性状均表现为质量性状遗传如抗病性~育性等可利用分子标记进行质量性状目标基因定位,吴旭红利用ISSR标记技术获得了一个与甜菜抗病基因紧密连锁的ISSR 标记ISSR0061 在F
2
群体分离中符合1=3的分离
比例有关ISSR标记BA00611200抗性基因连锁
的紧密程度还有待今后对F
2
分离群体进行个体寄主植株的抗病性鉴定和ISSR对应分析研究[19],吴旭红用BSA法和ISSR技术对155个随机引物进行筛选获得了一个与甜菜根腐病基因紧密连锁的IS-SR标记OPP0760 可以用作抗根腐病基因的选择依据[20],
2.4辅助选择育种
在育种实践中借助分子标记对目标性状的基因型进行选择称为标记辅助选择(MAS D,目前在黄瓜分子图谱中发现有较多紧密连锁的位点特别是一些形态学基因(F~dm~B~CcU~11D与一些分子标记间存在较紧密的连锁可实施标记辅助选择, Serguen等的研究表明标记辅助选择用于主茎长和多侧枝形状的选择是有效的[21],Yu等找到了与抗大豆花叶病毒基因(Rsv D紧密连锁的SSR标记遗传距离仅为0.15cM[22],可见通过分子标记辅助选育可以大大提高育种的选择效率为开展作物品种资源鉴定和遗传改良提供了一种快捷手段,
2.5品种纯度鉴定
利用分子标记技术进行园艺作物品种纯度鉴定不受环境~取材部位~时间等条件的限制其检测位点遍及整个基因组多态性高~准确~快速~信息量大可以区分出形态标记难以鉴别的细微差别,品种鉴定首先要构建品种的标准DNA指纹图谱将鉴定品种的指纹与标准指纹进行比较分析即可知道品种的纯度和真伪,Wolfe等用居群取样方法在玄参科吊钟柳属Penstemon杂种复合体中得到了10 ~24个种专一的ISSR标记清楚地支持了物种P.
clevelandii的二倍体杂种起源[23],秦莲花等用ITS 和ISSR分子标记技术鉴别香菇生产用种再次证明了ITS可以有效区别种之间的菌株;在ISSR的菌株水平分析中香菇种内材料拥有两个共同的条带与其他两种菌株的带型图谱有着明显差异其中5对材料的带型图谱极为相近,RAPD验证结果与上述结果相近,由此可见结合ITS与ISSR技术是可以用作香菇生产菌株鉴别的这为ITS和ISSR分子标记技术推广应用于香菇生产菌株的快速准确鉴别提供了技术依据[24],
3展望
分子标记作为一种新的遗传标记技术发展不过几十年却具有很强的生命力展现出广阔的应用前景和巨大的发展潜力,分子标记的应用为园艺作物遗传育种研究开辟了新的途径它为园艺作物种质资源和品种的鉴定~分类遗传图谱构建及目标性状基因标记等提供了理想的方法,ISSR标记因其引物容易设计实验重复性强操作过程简单不须使用同位素可以揭示更高程度的DNA多态性从而在植物遗传研究中具有广阔的应用前景,但任何一种分子标记都不能解决所有问题在今后的研究工作中我们应根据自己的研究目的选择合适的分子标记或将不同的标记结合起来进行综合研究以提高分子标记的选择效率,
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(责任编辑林涛)
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