Siglec-15在唑来膦酸特异性γδ T细胞活化、增殖及效应分子分泌中的作用

Siglec-15在唑来膦酸特异性γδT细胞活化、增殖及效应分子分泌中的作用①
游红琴王小昆徐本玲李铁鹏秦鹏刘雪张梦雨王瑶陈广玉高全立
（郑州大学附属肿瘤医院，河南省肿瘤医院，郑州450008）
中图分类号Q786R730.51文献标志码A文章编号1000-484X（2021）20-2466-04
［摘要］目的：探索唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-15（Siglec-15）对唑来膦酸（ZOL）特异性γδT细胞活化、增殖及分泌效应分子的影响。

方法：收集13例肺癌患者外周血，以ZOL联合或不联合重组Siglec-15蛋白刺激γδT细胞，流式细胞术检测γδT细胞的活化、增殖及效应分子分泌。

结果：CD69+和CD25+γδT细胞的比例在单独使用ZOL刺激与ZOL联合Siglec-15刺激之间的差异无统计学意义（P>0.05），增殖的γδT细胞比例在两组间的差异无统计学意义（P>0.05）；与ZOL单独刺激相比，ZOL联合Siglec-15刺激的γδT细胞分泌IFN-γ和颗粒酶B的水平降低（P<0.01，P<0.05）。

结论：Siglec-15在效应阶段抑制ZOL
特异性γδT细胞分泌IFN-γ和颗粒酶B。

［关键词］Siglec-15；γδT细胞；唑来膦酸；活化；增殖；效应分子分泌
Effects of Siglec-15on activation，proliferation and effectors secretion ofγδT cells stimulated by zoledronic acid
YOU Hong-Qin，WANG Xiao-Kun，XU Ben-Ling，LI Tie-Peng，QIN Peng，LIU Xue，ZHANG Meng-Yu，WANG Yao，CHEN Guang-Yu，GAO Quan-Li.Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University，Henan Cancer Hospital，Zhengzhou450008，China
［Abstract］Objective：To explore the influence of sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin15（Siglec-15）on activa‐tion，proliferation and effectors secretion of zoledronic acid（ZOL）-specificγδT cells.Methods：Peripheral blood of13patients with lung cancer was collected.ZOL alone or combinated with Siglec-15was used to stimulateγδT cells.Flow cytometry was used to detect activation，proliferation and effectors secretion ofγδT cells.Results：Ratio of CD69+and CD25+γδT cells were not statistically differ‐ent between ZOL stimulation alone and ZOL combinated Siglec-15stimulation（P>0.05）.There was no statistical difference in the pro‐portion of proliferatingγδT cells between the two pared with ZOL alone，levels of IFN-γand granzyme B secretion ofγδT cells stimulated by ZOL with Siglec-15decreased（P<0.01，P<0.05）.Conclusion：Siglec-15inhibits the secretion of IFN-γand gran‐zyme B by ZOL-specificγδT cells.
［Key words］Siglec15；γδT cells；Zoledronic acid；Activation；Proliferation；Effectors secretion
γδT细胞占外周血CD3+T细胞的5%~10%，可被磷酸抗原迅速活化，表达分化抗原簇（cluster of differentiation，CD）69和CD25，通过分泌颗粒酶、穿孔素及IFN-γ发挥抗肿瘤作用［1-2］。

在体外经磷酸小分子抗原扩增的γδT细胞被广泛用于肿瘤患者的过继治疗［3］。

唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-15（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin15，Sig-lec-15）是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素家族成员，最近的研究发现，Siglec-15可通过抑制CD4+和CD8+T细胞的增殖及IFN-γ的分泌，直接抑制特异性T细胞的抗肿瘤免疫应答［4］。

但Siglec-15对抗原特异性γδT细胞的影响尚未见报道，本研究旨在明确Siglec-15对γδT细胞活化、增殖和分泌效应分子的影响，以期为γδT细胞的临床应用提供理论基础。

1材料与方法
1.1材料肺癌血液标本为2019年12月至2020年4月河南省肿瘤医院免疫治疗科GMP实验室的临床检测标本，其中男性6例，女性7例。

唑来膦酸（zole‐dronic acid，ZOL）购自扬子江药业集团；IL-2购自山东泉港药业有限公司；淋巴细胞分离液购自美国GE 公司；流式抗体BV510-TCRγδ、FITC-CD3、PE-CD69、APC-CD3、APC-CD25、PE-颗粒酶B和APC-IFN-γ及同型对照抗体购自美国Biolegend公司；羧
doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2021.20.007
①本文为河南省医学科技攻关计划（联合共建）（LHGJ20190645）项目；河南省二〇二一年科技发展计划（202102310120）项目。

作者简介：游红琴，女，博士，主管技师，主要从事γδT细胞相关研究，E-mail：891020gh@。

基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（carboxyfluoresce‐in diacetate succinimidyl ester，CFSE）购自美国Ther‐mo Fisher公司；Fortessa流式细胞分析仪和FlowJo V10流式分析软件购于美国BD公司。

1.2方法
1.2.1γδT细胞的体外培养空腹抽取外周静脉血3ml于EDTA采血管，离心10min（2000r/min，离心半径10cm），取离心后的自体血浆备用。

全血细胞经生理盐水1∶1稀释后使用淋巴细胞分离液离心20min（2000r/min，离心半径10cm）吸取白膜层。

用无血清培养基重悬细胞，离心10min （1500r/min，离心半径10cm）去除血小板。

再次以无血清培养基重悬细胞，离心8min（1200r/min，离心半径10cm）获取外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。

用含3%自体血浆的X-VIVO培养基调整细胞浓度为1×106个/ml，分别添加ZOL（浓度为1μmol/L）和IL-2（浓度为400U/ml），将细胞悬液移入48孔板（1ml/孔），根据实验目的，在培养体系中加或不加Siglec-15（5μg/ml）重组蛋白。

置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

培养期间根据细胞生长情况进行补液和传代。

1.2.2γδT细胞活化相关分子的流式检测分别取培养前及培养第2和4天的γδT细胞悬液，离心5min（1500r/min，离心半径10cm）后，使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）重悬，调整细胞浓度为1×107个/ml，每管200μl，分别加入FITC-CD3、BV510-TCRγδ、PE-CD69和APC-CD25抗体各2μl，混匀，4℃避光孵育20min，孵育毕，使用PBS 洗涤1次，重悬于500μl PBS中，进行活化相关分子表达水平的检测。

1.2.3CFSE法检测γδT细胞的增殖将培养至第10天的γδT细胞（比例≥90%）静息培养（无IL-2培养）48h。

收集细胞，PBS洗涤2次，用5μmol/L 的CFSE工作液重悬细胞，于室温避光孵育20min，用5倍体积的冷完全培养基终止染色10min，离心洗涤2次后，以适量的完全培养液重悬细胞，将细胞悬液移入48孔板（1ml/孔），分别添加ZOL（1μmol/L）和IL-2（400U/ml），根据实验目的，在培养体系中加或不加Siglec-15（5μg/ml）。

置于37℃、5%CO2培养箱中避光培养72h。

在培养终点收集细胞，以APC-CD3和BV510-TCRγδ抗体进行表面流式染色，将细胞重悬于500μl PBS中进行γδT细胞增殖的流式检测。

1.2.4胞内流式分析γδT细胞分泌的效应分子
收集静息培养48h的γδT细胞，PBS洗涤后，将细胞悬液移入48孔板（1ml/孔），分别添加ZOL （1μmol/L）和IL-2（400U/ml），根据实验目的，在培养体系中加或不加Siglec-15（5μg/ml）。

置于37℃、5%CO2培养箱中培养4h后，加入布雷菲德菌素A
（brefeldin，BFA）阻断，继续培养2h。

收集上述不同培养条件的细胞，PBS洗涤1次，按照流式表面染色方法进行FITC-CD3，BV510-TCRγδ的表面染色。

PBS洗涤1次，固定细胞，室温避光孵育30min。

加入破膜液洗涤2次，以破膜液重悬细胞，加入PE-颗粒酶B抗体，APC-IFN-γ及同型对照抗体，4℃避光孵育30min。

破膜液洗涤2次后，将细胞重悬于500μl PBS中上机检测。

1.3统计学方法实验数据均采用SPSS19.0软件进行统计学分析。

数据为计量资料，服从正态分布，组间比较采用单因素t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果
2.1Siglec-15蛋白对ZOL诱导γδT细胞活化的影响不显著以ZOL联合或不联合重组Siglec-15蛋白刺激PBMC，在刺激48h和96h后分别检测表达活化相关分子CD69和CD25的γδT细胞比例（图1A）。

结果表明：ZOL刺激48h后，CD69+γδT细胞的比例由刺激前的（0.159±0.086）%上调至（85.48±6.605）%，刺激96h后，CD69+γδT细胞比例上调至（95.33±1.424）%，CD25+γδT细胞的比例由（0.005±0.004）%升高至48h的（50.94±18.678）%和96h的（87.53±2.612）%，差异有统计学意义（图1B~E），提示ZOL可刺激PBMC中的γδT细胞活化；联合Si‐glec-15刺激48h，CD69+和CD25+γδT细胞比例分别为（88.64±5.034）%和（62.56±14.951）%，与ZOL单独刺激的差异无统计学意义（P=0.421，P=0.350）；刺激96h的CD69+和CD25+γδT细胞比例分别为（95.80±1.250）%和（87.60±4.329）%，与ZOL单独刺激差异无统计学意义（P=0.990，P=0.815）（图1C、E），提示Siglec-15对ZOL诱导的γδT细胞活化无显著影响。

2.2Siglec-15不影响ZOL特异性γδT细胞的增殖收集纯度在90%以上的γδT细胞进行CFSE标记，并以ZOL联合或不联合Siglec-15刺激γδT细胞，在刺激72h后检测γδT细胞的分裂CFSE标记（图2A）。

ZOL刺激后，增殖的γδT细胞比例为（98.67±0.64）%；联合Siglec-15刺激，增殖的γδT 细胞比例为（98.2±0.38）%，两组间差异无统计学意义（P=0.426，图2B）。

上述结果表明Siglec-15不影响ZOL特异性γδT细胞的增殖。

2.3Siglec-15降低ZOL特异性γδT细胞分泌效应
分子IFN -γ和颗粒酶B 的水平
以ZOL 联合或不联
合Siglec -15刺激γδT 细胞（纯度≥90%），胞内流式分析γδT 细胞分泌IFN -γ和颗粒酶B 的水平（图3A ）。

结果显示，ZOL 单独刺激，使（11.98±1.98）%γδT 细胞分泌IFN -γ；联合Siglec -15蛋白刺激，分泌IFN -γ的γδT 细胞比例显著降低为（7.29±1.17）%
（P =0.006，图3B ）。

在ZOL 单独刺激组，有（89.35± 2.85）%γδT 细胞分泌颗粒酶B ，联合Siglec -15刺激
使分泌颗粒酶B 的γδT 细胞比例降低为（81.53±5.31）%，差异有统计学意义（P =0.041，图3C ）。

上述结果表明Siglec -15可通过抑制IFN -γ和颗粒酶B
的分泌负向调控ZOL 特异性γδT 细胞发挥效应。

3讨论
肿瘤免疫治疗的模式已经由激活全身性免疫
应答，转变为通过选择性纠正有缺陷的免疫应答促使免疫正常化。

例如针对程序性死亡受体-1（pro‐grammed cell death protein 1，PD -1）和细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T lymphocyte associated
protein ，CTLA -4）的单克隆抗体，就是通过阻断PD -1和CTLA -4恢复肿瘤特异性T 细胞的抗肿瘤效应［5］。

虽然免疫检查点抑制剂疗法在临床取得了显著疗
效，但目前单用PD -1和CTLA -4阻断剂治疗的有效率只有30%左右，提示除了PD -1和CTLA -4，肿瘤微环境中还存在未知的能够诱导肿瘤细胞逃逸的免疫检查点分子［6］。

据报道，Siglec -15在多种肿瘤细胞中的表达上调，但其对T 细胞抗肿瘤免疫应答的
影响尚不明确［7］。

陈列平团队的研究发现，Siglec -15可通过持续抑制T 细胞增殖及IFN -γ分泌进而抑制抗原特异性T 细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性，并通过小鼠肿瘤模型进一步证明了Siglec -15可作为肿瘤免疫治疗正常化策略的潜在靶点［4］。

γδT 细胞是人体发挥抗肿瘤免疫功能的重要
细胞，其T 细胞受体（T cell receptor ，TCR ）由γ
链和
图1CD69和CD25在γδT 细胞的表达
Fig.1
Expression of CD69and CD25in γδT cells
Note ：A.Gating strategy ；B.Representative flow cytometric analysis
results of CD69+
γδT cells ；C.Quantitative analysis of CD69+
γδ
T cells ；D.Representative flow cytometric analysis results of CD25+γδT cells ；E.Quantitative analysis of CD25+γδT cells.**.P <0.01；
NS.P >0.
05.图3γδT 细胞分泌IFN -γ和颗粒酶B
Fig.3
IFN -γand granzyme B secretion of γδT cells
Note ：A.Gating Strategy ；B.IFN -γsecretion of γδT cells under differ‐
ent stimulation conditions ；C.Granzyme B secretion of γδT cells under different stimulation conditions.*.P <0.05；**.P <0.
01.
图2γδT 细胞的增殖
Fig.2
Proliferation of γδT cells
Note ：A.Representative result of γδT cells proliferation under different
stimulation conditions ；B.Quantitative analysis of γδT cells pro‐
liferation.NS.P >0.05.
δ链组成［8］。

γδT细胞与经典的αβT细胞在活化、增殖及发挥效应方面有诸多相似之处。

两种细胞在受到TCR识别的抗原刺激时，均需要通过CD3分子传递活化信号，表达活化标记分子CD69和CD25［9-10］。

两种T细胞在活化后迅速增殖，数量成倍增加。

在效应阶段，γδT细胞的效应机制与αβT 细胞类似，通过释放穿孔素、颗粒酶诱导靶细胞死亡；表达Fas配体，通过Fas/FasL途径诱导靶细胞凋亡；分泌IFN-γ等细胞因子，促进肿瘤特异性T细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性［11-12］。

基于上述γδT细胞与αβT细胞的相似之处，本研究集中在Siglec-15对ZOL特异性γδT细胞活化、增殖及发挥效应的影响。

ZOL是含氮双磷酸盐，可抑制哺乳动物甲羟戊酸代谢通路中异戊烯焦磷酸（isopentenyldiphos‐phate，IPP）下游的法呢基焦磷酸合酶促使IPP在细胞内累积，累积的IPP通过TCRγδ激活γδT细胞［13］。

本研究以ZOL刺激外周血中的γδT细胞，无论Siglec-15是否存在，γδT细胞均可迅速活化与增殖。

与文献报道的Siglec-15可持续抑制αβT细胞增殖的结果不同，本研究结果提示Siglec-15不影响ZOL 诱导的γδT细胞的活化与增殖，推测这可能与两种细胞具备不同的抗原识别特点有关。

αβT细胞识别抗原的过程受到精细的调控，除TCR与抗原肽结合外，还需要CD80/CD86提供共刺激信号才能触发αβT细胞的活化与增殖。

为了维持免疫自稳，活化的αβT细胞同时上调免疫抑制分子的表达水平［14］；而γδT细胞的抗原识别对共刺激信号的依赖很小，不具有MHC限制性，表达免疫抑制性分子的数量较αβT细胞更少，表达水平更低［15］。

在特异性T细胞的抗肿瘤免疫应答中，Siglec-15以类似PD-L1的角色发挥抑制作用，但T细胞表面表达的介导Siglec-15发挥免疫抑制效应的受体尚不明确，其在T细胞上的表达特点未知。

本研究结果表明，Siglec-15对γδT细胞的活化与增殖无显著影响，提示在此阶段，γδT细胞不表达或低水平表达Siglec-15的受体。

本研究的另一个发现：与Siglec-15抑制αβT细胞分泌IFN-γ相似，Siglec-15可显著降低γδT细胞产生效应分子IFN-γ和颗粒酶B的水平，表明在效应阶段γδT细胞表达了Siglec-15受体或受体的表达水平上调。

综上，在活化增殖阶段，Siglec-15对ZOL特异性γδT细胞的抑制作用不显著，但在效应阶段可通过抑制IFN-γ和颗粒酶B的分泌负向调控ZOL特异性γδT细胞发挥效应。

这对探讨γδT细胞在临床治疗肿瘤患者方面有一定的价值。

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［收稿2020‐08‐24修回2020‐11‐23］
（编辑陈阳）。