胶乳微球与抗体蛋白相互作用机理的荧光光谱法分析
胶乳免疫比浊法与荧光免疫层析法的原理
胶乳免疫比浊法与荧光免疫层析法的原理胶乳免疫比浊法与荧光免疫层析法是两种常用的免疫学检测方法，它们在医学领域中起着重要的作用。
胶乳免疫比浊法主要利用抗原与特定抗体结合后，使得溶液浑浊度增加的特性，通过比浊度的变化来判断样品中是否含有特定抗体或抗原。
而荧光免疫层析法则是利用特定荧光标记的抗体与抗原结合后，在荧光检测器上显示荧光信号的原理。
这两种方法在实际应用中各有优劣之处，本文将对这两种方法的原理、应用和发展进行探讨。
首先，胶乳免疫比浊法是一种比较传统的免疫学检测方法，其原理比较简单，操作相对容易。
在这种方法中，首先需要将待检测的抗原与特异性抗体混合，形成抗原-抗体复合物。
当复合物形成后，会导致溶液的浑浊度增加，通过光学方法检测溶液的浊度变化，从而判断样品中是否含有特定的抗体或抗原。
这种方法具有灵敏度高、速度快和成本低的特点，被广泛应用于临床、生物学和环境监测等领域。
然而，胶乳免疫比浊法也存在一些局限性，例如其灵敏度有一定的限制，只能检测较高浓度的抗原或抗体。
另外，由于比浊法是通过测定溶液的浑浊度来判断样品中的抗原或抗体，对于复杂样品的检测可能存在干扰。
因此，在一些需要更高灵敏度和特异性的应用场景下，研究人员开始寻找更加先进的免疫检测方法，其中荧光免疫层析法便是一种备受关注的新型技术。
荧光免疫层析法是一种结合了免疫学和荧光技术的先进检测方法，其原理是利用特定荧光标记的抗体与抗原结合后，在荧光检测器上显示荧光信号。
荧光免疫层析法具有灵敏度高、特异性好、多样性强等优势，被广泛用于生物医学、食品安全和环境监测等领域。
相比于胶乳免疫比浊法，荧光免疫层析法具有更高的灵敏度和特异性，能够检测到低浓度的抗原或抗体，并且可以应用于更加复杂的样品中。
荧光免疫层析法的应用范围也在不断扩大，不仅可以用于传统的生物学检测领域，还可以应用于分子诊断、药物研究和生化反应动力学等领域。
在医学诊断领域，荧光免疫层析法已经成为一种常用的检测方法，可以用于检测各种疾病的标志物，如癌症标志物、感染性疾病的诊断等。
荧光微球标记抗体制备的详细步骤及问题分析
荧光微球标记抗体方法及问题分析很多公司开展了荧光胶乳免疫层析做定量分析及胶乳增强免疫比浊分析项目，关注胶乳标记技术的技术人员越来越多。
本人总结了部分胶乳微球标记技术相关主题帖，并加以分类，以便朋友们查阅，希望朋友们继续完善或分享经验。
1. 胶乳大小选择【求助】免疫胶乳或免疫颗粒（聚苯乙烯）的粒径免疫胶乳或免疫颗粒（聚苯乙烯）的粒径- 丁香园论坛【求助】乳胶免疫比浊中的乳胶颗粒大小与抗体乳胶免疫比浊中的乳胶颗粒大小与抗体- 丁香园论坛2. 胶乳标记方法【交流】蛋白如何偶联到聚苯乙烯乳胶颗粒上蛋白如何偶联到聚苯乙烯乳胶颗粒上- 丁香园论坛（求助）胶乳标记（求助）胶乳标记- 丁香园论坛【求助】抗原或抗体致敏胶乳的缓冲液和pH值抗原或抗体致敏胶乳的缓冲液和pH值- 丁香园论坛3. 胶乳标记过程问题【求助】胶乳偶联出现絮凝胶乳增强免疫比浊试剂稳定性问题- 丁香园论坛【求助】胶乳增强免疫比浊中抗体交联的问题胶乳微球物理吸附反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用来设计被动吸附蛋白。
磺酸基微球表面含带有负电荷的磺酸基团，pka大约为2，因此在酸性pH保持稳定。
醛基微球表面也带有磺酸基团，但能和蛋白行程共价键。
羧基微球表面含带负电荷的羧基基团，在pH5.0以上时保持稳定。
带有疏水基团的蛋白的吸附和配位结合，是最简单和直接的标记方法。
这种方法中，微球溶液和含目标蛋白的溶液混合，反应后，未结合的游离蛋白通过清洗步骤除去，从而获得胶体蛋白复合物。
疏水吸附方法只能用于疏水微球（硫酸盐、羧基、醛基表面修饰的微球）。
醛基表面修饰微球是一个特例，其疏水吸附结果取决于后来的共价结合。
虽然物理吸附是不依赖pH的，但反应缓冲液的pH对蛋白的结构有非常大的影响，从而影响蛋白吸附到微球上的反应效率。
一般，在被吸附蛋白等电点附近pH时，物理吸附效率会很高。
反应步骤：1. 用反应缓冲液系数蛋白到10mg/ml；2. 用反应缓冲液系数胶乳微球到1%；3. 将蛋白溶液加入到胶乳微球溶液中，10ml胶乳中加入1ml蛋白溶液。
荧光微球与抗体偶联机理
荧光微球与抗体偶联机理荧光微球是一种具有荧光性质的微小颗粒，通常由聚合物或玻璃等材料制成。
荧光微球具有较强的荧光信号，可以用于生物医学研究、生物分析和生物检测等领域。
而荧光微球与抗体的偶联则是将荧光微球与特定的抗体结合，以实现对特定生物分子的检测和定量分析。
荧光微球与抗体偶联的机理主要包括两个方面：荧光微球的表面修饰和抗体的偶联。
荧光微球的表面修饰荧光微球的表面修饰是将荧光微球表面的官能团与化学试剂反应，引入特定的官能团，以便与抗体进行偶联。
常用的表面修饰方法包括羧基化、氨基化、硫酸化等。
羧基化是将荧光微球表面的羟基官能团与羧酸化试剂反应，引入羧基官能团。
羧基官能团可以与氨基化试剂反应，引入氨基官能团，也可以与硫酸化试剂反应，引入硫酸基官能团。
氨基化是将荧光微球表面的羟基官能团与氨基化试剂反应，引入氨基官能团。
氨基官能团可以与羧基化试剂反应，引入羧基官能团，也可以与硫酸化试剂反应，引入硫酸基官能团。
硫酸化是将荧光微球表面的羟基官能团与硫酸化试剂反应，引入硫酸基官能团。
硫酸基官能团可以与氨基化试剂反应，引入氨基官能团，也可以与羧基化试剂反应，引入羧基官能团。
表面修饰后的荧光微球表面具有特定的官能团，可以与抗体进行偶联。
抗体的偶联抗体是一种特异性很强的蛋白质，可以与特定的抗原结合。
抗体的偶联是将抗体与荧光微球表面的官能团进行化学反应，实现抗体与荧光微球的结合。
常用的抗体偶联方法包括生物素-亲和素系统、氨基酸偶联、交联剂偶联等。
生物素-亲和素系统是将荧光微球表面的生物素与抗体偶联。
生物素是一种小分子，可以与亲和素结合，形成稳定的生物素-亲和素复合物。
抗体可以与生物素-亲和素复合物结合，实现抗体与荧光微球的结合。
氨基酸偶联是将荧光微球表面的氨基酸与抗体偶联。
氨基酸可以与抗体中的半胱氨酸残基进行化学反应，形成稳定的氨基酸-半胱氨酸偶联物。
抗体可以与氨基酸-半胱氨酸偶联物结合，实现抗体与荧光微球的结合。
交联剂偶联是将荧光微球表面的交联剂与抗体偶联。
光谱法研究聚赖氨酸与纤维蛋白原的相互作用
光谱法研究聚赖氨酸与纤维蛋白原的相互作用蔡建周;张武【摘要】Poly-L-lysine is an important polycation which has great prospect in the biomedical application.However,there are few reports on the blood compatibility of poly-L-lysine at present,especially the interaction between poly-L-lysine and some im-portant proteins from the blood,which is studied with spectroscopic methods.Therefore,it is of certain innovation to further evaluate the blood compatibility of poly-L-lysine,which is studied by the interaction between poly-L-lysine and fibrinogen with many spectroscopic methods.In this study,the fluorescence,ultraviolet visible and circular dichroism spectroscopy were used to research the effects of poly-L-lysine on the structure of fibrinogen.Briefly,zeta potential experiment showed that positive poten-tial of poly-L-lysine increased with increasing plexation experiment showed that 0.01 mg·mL-1 poly-L-ly-sine had little effect on the function of fibrinogen,and the interaction strengthened with concentration increasing.Fluorescence spectra showed that the fluorescence of fibrinogen was quenched in a concentration dependent way when the emission wavelength was 341 nm (λem=341 nm).Ultraviolet visible spectra showed that the absorption intensity of fibrinogen at 200~240 and 278 nm,which was less affected by 0.025 mg·mL-1 poly-L-lysine,reduced with the concentration of poly-L-lysine increasing.Cir-cular dichroism spectra showed when the concentration of poly-L-lysine increased,the effect of poly-L-lysine on the secondarystructure of fibrinogen strengthened.Overall,as the concentration of poly-L-lysine increased,theα-helix content of fibrinogen decreased and theβ-fold,β-turn and random coil content of fibrinogen increased.These results showed that the electrostatic in-teraction was occurred between poly-L-lysine and fibrinogen,which influenced the structure of fibrinogen by concentration de-pendence.While the effect of poly-L-lysine (0.01 and 0.025 mg·mL-1 )on fibrinogen was little,poly-L-lysine of high concen-tration would damage the physiological function of fibrinogen.Therefore,it is necessary to consider the concentration factor in the development and application of poly-L-lysine.In this study,a simple,convenient and systematic method is utilized to study the interaction between materials and fibrinogen,which is helpful to evaluate the blood compatibility of materials sufficiently. Furthermore,the results of this study will provide important guiding information for the biomedical applications of poly-L-ly-sine.%聚赖氨酸是一种重要的聚阳离子,在生物医药领域具有广泛的应用前景。
胶乳微球与抗体蛋白相互作用机理的荧光光谱法分析
光谱法 （ ＿ ｓ 、圆二 色谱法 （ Ｄ） ｕｖ ） Ｃ 、傅里 叶变换 红外 光谱
法 （ Ｉ Ｒ 及核磁共振法 （ Ｋ＇ ） Ｉ ＮＭＲ）７ 。 而 ，在这 些方 法 中， Ⅲ。 然 。
乳 的凝 聚作用 ， 免疫反应从宏观上被放 大 了。所以将不 同的 抗原 ／ 抗体连接在胶乳 微球 表 面，通 过免 疫检 测 ，可将 一些 常见 疾病 ， 如肝炎 、流感等快速检测 出来 。 常用 的制备胶乳一 体蛋 白复合 物 的方法 有两 种 ：物理 抗 吸附法和共价偶联法。由于吸附会引起固定于胶乳 微球表 面 蛋 白的部分解 吸及结构的变化 ， 以用物理吸 附法制备 的胶 所 乳一 抗体蛋 白复合物特 异性低 ，在生物 诊 断 中的应用 受到 限 制Ⅲ ］ ４ 。共价偶联法能在最 大 限度 上控 制吸 附法 中出现 的问 题 ， 为 目前制备胶乳一 成 抗体蛋 白复合物 的主要方法 。 在胶乳一 抗体蛋 白复合 物 的制备 过程 中 ， 白 与胶乳 微 蛋
公司 ；１苯 胺基 萘一一 － ８硝基 苯 甲酸 盐 （ ＡＮＳ ，美 国 Ｓｇ ） ｉｍａ公
球的相互作用总会存在 ， 而这些相互作用会 对 固定 于胶 乳微
球表面抗体蛋 白的功能特性 、空间结构 、生物 活性及其 在生 物诊断 中的应用产 生一定 的影 响，所以研 究它们之 问相互作 用 的机理 以及这些 相互作 用对胶 乳一 抗体蛋 白复合 物 中抗体
司； 其余化学试剂均为分析纯 ；实验用水为去离子水 。
１ ２ 主要 仪 器 ．
超 声 波 细 胞 粉 碎 机 （Ｙ ９ Ｉ 型 ） Ｊ －２Ｉ ，宁 波 新 芝 生 物 科 技 股
基于光谱学解析乳液凝胶体系中分子动态机制
基于光谱学解析乳液凝胶体系中分子动态机制光谱学在解析乳液凝胶体系中分子动态机制方面发挥了重要作用。
乳液凝胶体系是由水相和非水相组成的，具有乳液和凝胶的双重特性，在许多领域具有重要的应用价值。
光谱学可以通过观察不同波长的光在乳液凝胶体系中的吸收、发射、散射等现象，帮助科学家了解分子在其中的动态机制。
本文将从乳液凝胶体系的结构特点入手，介绍光谱学在解析乳液凝胶体系中分子动态机制方面的应用，从而探讨其在相关领域中的潜在应用价值。
首先，乳液凝胶体系的结构特点。
乳液是一种由液体固体悬浮粒子所组成的胶体溶液，其主要由水相和油相组成。
在乳液中，水相和油相通过表面活性剂等物质形成胶束结构，使得乳液具有较好的稳定性和流变性。
当乳液中的水相或油相发生凝胶转变后，便形成了乳液凝胶体系。
乳液凝胶的结构稳定性和特殊的流变性使得其在医药、化妆品、食品等领域具有广泛的应用价值。
在乳液凝胶体系中，分子的动态机制是十分复杂的。
科学家们通过光谱学技术，可以观察到不同波长的光在乳液凝胶体系中的吸收、发射、散射等现象，从而了解分子在其中的动态机制。
例如，通过红外光谱技术，可以观察凝胶中分子的振动和伸缩等特征，从而推断分子的空间结构和相互作用方式。
通过紫外-可见吸收光谱技术，可以观察凝胶中分子的能级结构和电子跃迁等特征，从而了解分子的电子结构和激发态行为。
通过荧光光谱技术，可以观察凝胶中分子的荧光特性，从而了解其在激发态下的动态行为等。
这些光谱学技术为科学家们提供了研究乳液凝胶体系中分子动态机制的有力工具。
光谱学在解析乳液凝胶体系中分子动态机制方面的应用具有广泛的潜在应用价值。
首先，在医药领域，通过研究乳液凝胶体系中药物分子的动态行为，可以帮助科学家们设计出更加稳定和有效的新型药剂，从而提高药物的疗效和生物利用度。
其次，在化妆品领域，通过研究乳液凝胶体系中活性成分的动态行为，可以帮助科学家们改进化妆品的配方和性能，从而提高化妆品的质量和使用感受。
亲和乳胶微球的研究及应用_曾庆辉
化工进展CH EM ICA L I ND U ST RY AN D EN GIN EERIN G P ROG RESS亲和乳胶微球的研究及应用曾庆辉方仕江(浙江大学高分子工程研究所,杭州310027)摘要介绍了亲和乳胶微球及微球的设计要求和原理,综述了国内外相关内容的研究进展,着重对微球的制备研究进行了说明。
同时对亲和乳胶微球在生化识别分离、DN A免疫诊断、药物载体等生物医药领域的应用作了介绍,并指出该领域的研究重点和发展前景。
关键词亲和乳胶;乳液聚合;功能微球;生化应用中图分类号O63;Q81文献标识码A文章编号10006613(2005)10110305 S yntheses and Applications of Affinity Latex MicrospheresZeng Qinghui,F ang S hij iang(Inst itute of Po ly mer Engineer ing,Zhejiang U niv ersity,H angzho u310027)Abstract The syntheses of affinity latex micro sphere are reviewed from the view points of synthesis principles and pr epar ation process.The applications of microspheres to the areas of bio-separation, DNA diagnosis,drug carrier and so on are also intr oduced.Keywords affininty latex;emulsion poly merizatio n;functional microsphere;bioapplicatio n近年来,功能性高分子微球的研究备受重视。
一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法
一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法引言：羧基乳胶微球是一种常用的载体材料，在生物技术、生物医学研究等领域有着广泛的应用。
将羧基乳胶微球与抗体偶联可以实现抗体的定向、高效地与靶分子结合，从而用于生物分析、诊断和治疗等应用。
本文将介绍一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，以及该方法的优势和应用前景。
方法：1.材料准备：- 羧基乳胶微球：可通过合适的乳化聚合方法制备，其粒径一般控制在100-1000 nm之间。
-交联剂：羧基乳胶微球一般表面具有丰富的羧基官能团，可通过与交联剂反应实现微球的交联，增强抗体的稳定性。
-免疫活性分子：选择与目标抗体匹配的免疫活性分子，如胺基酸、蛋白质等。
2.羧基乳胶微球表面修饰：使用化学方法将胺基酸、蛋白质等与羧基乳胶微球反应，实现羧基乳胶微球表面的修饰和激活，增加偶联反应的效率和稳定性。
3.抗体偶联：将修饰后的羧基乳胶微球与目标抗体进行偶联，可采用传统的化学偶联方法，如活化的EDC/NHS法、硫酸亚铁/亚砜法等。
将抗体与羧基乳胶微球充分混合，在适当的反应条件下（pH、温度等），进行偶联反应。
4.反应后的处理：偶联反应后，通过洗涤等方法去除未偶联的抗体和副产物，得到羧基乳胶微球与抗体稳定结合的产物。
优势和应用前景：-选择合适的乳化聚合方法和交联剂，可控制羧基乳胶微球的粒径和形貌，使其具有较大比表面积和较好的稳定性。
-通过表面修饰，增加羧基乳胶微球与抗体之间的亲和力和稳定性，提高偶联效率。
-该方法操作简单、成本较低，适用于大规模生产。
-偶联的羧基乳胶微球具有良好的生物相容性和稳定性，可用于体内外生物学研究、诊断和治疗等领域。
-偶联的羧基乳胶微球可用于靶向传递药物、检测靶分子、研究生物分子交互作用等应用。
总结：本文介绍了一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，该方法可以实现抗体的定向、高效地与靶分子结合。
该方法具有操作简单、成本低、适用性广等优点，并在生物学研究、诊断和治疗等领域具有广阔的应用前景。
荧光微球与抗体偶联机理
荧光微球与抗体偶联机理1. 引言荧光微球与抗体偶联是一种重要的生物分析技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
荧光微球作为一种高度稳定且具有特定荧光性质的纳米材料，可以通过与特定的抗体结合，实现对目标分子的高灵敏度、高选择性检测。
本文将详细介绍荧光微球与抗体偶联的机理及其应用。
2. 荧光微球的制备荧光微球是一种具有特定尺寸和荧光性质的纳米材料，其制备方法多种多样。
常见的制备方法包括溶胶-凝胶法、乳化聚合法和界面聚合法等。
其中，溶胶-凝胶法是最常用的方法之一。
溶胶-凝胶法制备荧光微球的步骤如下：1.选择适当的原料：通常使用有机硅化合物作为主要原料，例如正硅酸乙酯（TEOS）。
2.制备溶液：将有机硅化合物与溶剂（如乙醇）混合，加入催化剂（如氨水）和稳定剂（如聚乙二醇）。
3.凝胶形成：将混合溶液静置，待其自行凝胶化。
4.固化处理：将凝胶体进行固化处理，通常使用高温煅烧或紫外光照射等方法。
5.荧光修饰：通过添加荧光染料或掺杂荧光物质的方法，对微球进行荧光修饰。
通过上述步骤，可以得到具有一定尺寸和荧光性质的荧光微球。
3. 抗体的制备与特性抗体是一种由机体产生的特异性蛋白质，能够识别并结合特定抗原。
抗体通常由B细胞分泌，在人体的免疫应答中起到重要作用。
抗体具有以下特性：•特异性：每种抗体只能与一个特定的抗原结合。
•亲和力：抗体与抗原结合的强度。
•结构多样性：不同的抗体可以通过基因重组产生，具有不同的结构和功能。
抗体的制备通常包括以下步骤：1.免疫原制备：选择目标抗原，通过重组蛋白、合成肽段或提取天然蛋白等方法，制备免疫原。
2.动物免疫：将免疫原注射到实验动物体内，激发其免疫系统产生特异性抗体。
3.抗体分离和纯化：从动物的血清或淋巴细胞中分离和纯化目标抗体。
4. 荧光微球与抗体的偶联机理荧光微球与抗体的偶联是通过特定的化学反应实现的。
常用的偶联方法包括活性酯化、亲电取代、双功能交联剂等。
以活性酯化为例，荧光微球表面可以引入含有反应活性基团（如羧酸）的官能团。
绞股蓝皂苷与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱研究
绞股蓝皂苷与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱研究何丽君;霍彩霞;杨彩玲;魏玉荣【摘要】The interaction between gypenoside and bovine serum albumin (BSA) in tris-HCl buffer solution (pH = 7.40) was studied by means of fluorescence spectroscopy. Number of binding sites and binding constant for gypenoside and BSA were determined based on calculation; and their binding modes were explored based on thermodynamic analysis. In the meantime, the effect of gypenoside on the configuration of BSA was examined by means of synchronous fluorescence spectroscopy. It was found that gypenoside quenched the fluorescence of BSA via a static quenching process, and hydrophobic and electrostatic interactions playeda major role in the binding of gypenoside and BSA.%用荧光光谱技术研究了绞股蓝皂苷与牛血清白蛋白(BSA)在pH=7.40的Tris-HCl缓冲溶液中的相互作用；通过计算确定了绞股蓝皂苷与BSA的结合位点数和结合常数,利用热力学分析探讨了绞股蓝皂苷与BSA之间的结合方式；同时采用同步荧光技术考察了绞股蓝皂苷对BSA构象的影响.结果表明,绞股蓝皂苷对牛血清白蛋白的荧光猝灭过程为静态猝灭；二者主要靠疏水作用和静电引力结合.【期刊名称】《化学研究》【年(卷),期】2012(023)001【总页数】4页(P67-70)【关键词】绞股蓝皂苷;牛血清白蛋白;相互作用;荧光光谱【作者】何丽君;霍彩霞;杨彩玲;魏玉荣【作者单位】兰州城市学院化学与环境科学学院,甘肃兰州730070;兰州城市学院化学与环境科学学院,甘肃兰州730070;兰州城市学院化学与环境科学学院,甘肃兰州730070;兰州城市学院化学与环境科学学院,甘肃兰州730070【正文语种】中文【中图分类】O657.39血清白蛋白是生物体内含量最丰富的运输蛋白质，是生物体内具有重要生理功能的大分子，并且血液中血清白蛋白浓度长期以来一直是检验健康和疾病的指标.研究药物等小分子物质与血清蛋白相互作用的机理和作用过程，有助于认识药物的运转和代谢过程，在毒理学、药代动力学上有重要意义[1].绞股蓝皂苷（GPs）是绞股蓝的主要有效成分，含有与人参皂苷结构相同的四环三萜达玛烷，有显著降血脂、降血糖、平衡血压、抗癌、抗疲劳、抗缺氧、抗衰老、促进细胞新陈代谢，强壮补益等作用，且无毒副作用[2].作者利用荧光光谱技术，研究了模拟生理条件（pH＝7.40）下GPs与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用，从获得的光谱数据分析了它们的作用机理，键合常数、热力学参数及GPs对蛋白质微环境的影响.RF－5301PC型荧光分光光度计（日本，岛津公司）、pHS－TP型酸度计，HH －S型恒温水浴锅.牛血清白蛋白（北京奥博星生物技术责任有限公司），绞股蓝皂苷（中国药品生物制品检定所），pH＝7.40的Tris－HCl缓冲溶液.Tris、HCl、氯化钠等均为分析纯，实验用水为超纯水.以Tris－HCl缓冲溶液分别配制2.0×10－5 mol·L－1的BSA标准溶液和3.9×10－4 mol·L－1的绞股蓝皂苷标准溶液，两种标准溶液都在4℃冰箱中保存，实验所用溶液由此标准溶液配制而得.移取一定量的BSA溶液于1cm石英比色皿中，用微量进样器分别注入不同体积的GPs溶液.以280 nm为激发波长，在荧光分光光度计上记录290～450nm波长范围内的荧光光谱.移取1.997 6×10－6 mol·L－1的BSA溶液3mL于1cm石英比色皿中，用微量进样器分别注入不同体积的GPs溶液，累加体积＜150μL，反应时间为8min.以280nm为激发波长，在荧光分光光度计上分别记录不同温度下，290～450nm波长范围内的荧光光谱.改变发射波长λem与激发波长λex之间的波长差Δλ，λem＝λex＋Δλ，分别在Δλ＝15nm和Δλ＝60nm下测定BSA与GPs不同浓度下的发射峰强度及峰位.模拟人体生理条件，在pH＝7.40条件下，固定BSA浓度，改变GPs浓度，得到GPs与BSA相互作用的荧光光谱图.由图1可知，随GPs浓度的增加，BSA的荧光强度逐渐降低，这表示在加入GPs后，GPs与BSA发生了相互作用，生成了不发荧光的基态配合物，从而猝灭了BSA内色氨酸残基的荧光（大多数情况下可认为蛋白质的荧光主要来自色氨酸的贡献）.同时，体系中BSA的最大发射峰从338nm轻微蓝移到333nm，表明二者的相互作用使BSA发色团的微环境发生了变化.引起BSA荧光猝灭的原因可能有动态猝灭和静态猝灭，动态猝灭过程遵循Stern－Volmer方程[3].式中：F0和F分别为不存在和存在猝灭剂时荧光物质的荧光强度；Kq为双分子猝灭过程速率常数，τ0为猝灭剂不存在时物质的荧光寿命（对大多数生物分子τ0大约为10－8 s）[4].KSV为动态猝灭常数，[Q]为猝灭剂的浓度，显然有KSV＝Kqτ0，以Fo/F－1对[Q]作图，可求得猝灭常数KSV及猝灭速率常数Kq.284K时，猝灭速率常数为2.994×1012L·mol－1·s－1；310K时，猝灭速率常数为1.913×1012 L·mol－1·s－1.一般认为，各类猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭速率常数为2×1010 L·mol－1·s－1[4].从结果可知，GPs对BSA荧光猝灭速率常数在1010以上，可以初步判断加入GPs导致BSA荧光猝灭过程是以静态猝灭为主.动态猝灭和静态猝灭还可以依据猝灭常数随温度不同的变化来区别.对于动态猝灭，温度升高，将增加有效碰撞的粒子数目，加剧电子的转移，使荧光物质的猝灭常数随温度升高而增大；若是静态猝灭，温度升高将降低复合物的稳定性，使猝灭常数减小.图2是284K和310K下GPs与BSA作用的Stern－Volmer拟合曲线，可以看到，随温度升高，Stern－Volmer方程的斜率减小，进一步表明该过程是以静态猝灭为主.小分子与大分子结合时其表观结合常数Kb及结合位点数n由下式求出[5－6]：F0和F分别为不存在和存在猝灭剂时荧光物质的荧光强度，Kb为BSA与GPs之间的表观结合常数，[Q]为猝灭剂的平衡浓度，n为结合位点数.由式（2）作出体系的关系图.通过斜率和外推截距可以求出BSA与药物之间的表观结合常数和结合位点数，结果见表1.由表1可看出，结合位点数n接近1，说明GPs与BSA可形成1个结合位点.表观结合常数为104数量级，表明GPs与BSA之间有较强的结合，可以被蛋白质运输和储存.药物等有机小分子和蛋白质等生物大分子之间的作用力属于分子间的弱相互作用力，主要包括氢键、范德华力、静电引力和疏水作用力等.根据反应前后热力学焓变ΔrHθm和熵变ΔrSθm的相对大小，可以判断药物与蛋白质之间的主要作用力类型[7].在温度变化不大时，反应的焓变和熵变可以看作一常数，通过热力学公式：式中K为猝灭常数KSV，R为气体常数，计算出不同温度下GPs与BSA作用的自由能变和熵变数据见表2.由表2可知可见GPs与BSA相互作用是一个放热、熵增，可以自发进行的反应.根据Ross[7]等总结出判断生物大分子与小分子结合力性质的热力学规律：ΔS＞0，可能是疏水力和静电作用力；ΔS＜0，可能是氢键和范德华力；ΔH＞0，ΔS＞0，为典型的疏水力；ΔH＜0，ΔS＜0，为氢键和范德华力；ΔH≈0或较小，ΔS＞0，为静电作用力；ΔH＜0时静电作用力为主要作用力，推断出GPs与BSA之间的作用力非单一作用力，主要是疏水作用力和静电作用力.利用同步荧光光谱可以分析蛋白质的构象[8].由Δλ＝15nm所得到的同步荧光只显示蛋白质酪氨酸残基的光谱特性，而Δλ＝60nm的同步荧光只表现色氨酸残基的荧光.从图3中可看出，随药物浓度的增大，酪氨酸残基荧光强度几乎不变，GPs主要猝灭了BSA的色氨酸残基的荧光（Δλ＝60nm），且其最大荧光发射峰出现很轻微的蓝移，说明药物的加入使蛋白的构象发生一些变化.通过对蛋白质内源荧光的研究得知，蛋白质分子在极性溶剂中发射的荧光光谱的波长比它在非极性溶剂中的长，即溶剂极性降低，荧光光谱发生蓝移，根据这一规律可知色氨酸残基所处环境的疏水性有所降低[9].利用荧光光谱技术研究了生理条件下GPs与BSA的相互作用.发现GPs对BSA具有荧光猝灭作用，该猝灭过程属于静态猝灭.其结合位点数为1，结合常数的数量级在104左右，说明GPs与BSA之间有较强的结合.通过计算得到的热力学数据，推断出GPs与BSA之间主要靠疏水作用力和静电引力结合.并通过同步荧光发现GPs对BSA的构象有一定影响.【相关文献】[1]MCMENAMY R H.Albumin structure、function and uses[M].Oxford：Dergamon Press，1977.[2]李群峰.绞股蓝的化学成分及药理作用研究进展[J].光明中医，2009，24（12）：2396－2397.[3]陈国珍.荧光分析法[M].北京：科学出版社，1990.[4]许金钩，王尊本.荧光分析法[M].北京：科学出版社，2006：67.[5]张勇，张贵珠，王月梅，等.光谱法研究丝裂霉素，血清白蛋白以及金属离子间的相互作用[J].分析科学学报，2000，16（6）：445－449.[6]魏晓芳，刘会洲.Triton X－100与牛血清白蛋白的相互作用[J].分析化学，2000，28（6）：699－701.[7]ROSS P D，SUBRAMANIAN S.Thermodynamics of protein association reactions：forces contributing to stability[J].Biochemistry，1981，20（11）：3096－3102.[8]杨曼曼，杨频，张立伟.荧光法研究咖啡酸类药物与白蛋白的作用[J].科学通报，1994，39（1）：31－35.[9]孙崇荣，李玉民.蛋白质化学导论[M].上海：复旦大学出版社，1991.。
胶乳试剂的波长
胶乳试剂的波长
胶乳试剂的波长取决于所使用的胶乳种类以及试剂的组成。
胶乳是一种悬浊液，其中含有分散在液体中的固体粒子。
根据固体粒子的种类和大小不同，胶乳试剂在可见光波长范围内可能会呈现不同的吸收和散射特性。
一般来说，胶乳试剂在可见光波长范围内具有吸收和散射的特性。
胶乳试剂的吸收特性会导致它对某些波长的光吸收，而散射特性会导致它对光的传播产生散射现象。
这些特性会在胶乳试剂的颜色和透明度方面产生影响。
因此，具体胶乳试剂的波长可以通过光谱分析等实验手段来确定。
乳胶标记常见问题汇总
胶乳标记过程中常见问题集1）问题：蛋白无法吸附到微球上。
解决方法：加入更多的蛋白；去除微球中的表面活性剂，释放其占据的蛋白结合位点；引入中间物，将微球与蛋白相连；改变缓冲液。
2）问题：标记时加入了大量的蛋白，但是仍然无活性。
解决方法：改变蛋白加入量，从而改变蛋白与微球结合的空间构象；使用表位稀释物，占据微球上的部分蛋白结合位点，防止蛋白靠的太近。
3）问题：清洗去除未吸附蛋白后，微球聚集。
解决方法：增加蛋白标记量或封闭剂的用量，防止有空余位点；4）问题：标记后开始活性很好，储存一段时间后，活性降低。
解决方法：降低储存温度到2~8度；降低储存液中的封闭剂浓度，防止抗体被替换；确认储存液中无能与抗体竞争的杂质，防止长时间取代抗体。
5）PS微球与蛋白（抗体）交联后，当时没发现有凝集，但隔夜后发现有凝集是偶联效率低的原因。
当体系蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交联后还空出许多反应基团时，由于这些基团又可以与相连微球上的蛋白反应，结果是把球又拉在一起了，所以有聚集。
可以加一些blocker agents 解决,常见的是BSA，另外，也可提高微球的交联率。
但为什么是过一段时间后才出现凝集呢，这是因为微球偶联上蛋白后，相互之间由于携带同种电荷的关系，比较稳定（所以能以胶体样存在），只有当偶尔相互碰撞，遇上彼此的反应基团时才能结合。
6）抗体偶联至羧基PS球，即时检测效果很好，但置于37度2天后，抗体活性似乎下降很大。
可能共价结合未成功，如果是这样，那么最主要的原因是EDAC质量差或过期了。
EDAC 长期放在空气中会吸潮，水汽会降低EDAC活性。
另一个可能原因是凝集。
观察胶乳是否有凝集产生。
还有，交联蛋白前有没有清洗？我们提供的胶乳缓冲液中含有表面活性剂，可能干扰抗体的结合。
如果未发生凝集，而且用前已经清洗，那么我们建议换新的EDAC。
7）EDC活化羧基乳胶微球后，加蛋白（抗体）即时有沉淀出现，是什么原因？很多因素可以导致蛋白加入后，微球聚集成块。
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Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ／ｎｍ Ｆｉｇ．２ Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｆｌｕｏｒｃｓ∞ｎｒｅ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｌａｔｅｘ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌａｔｅｘ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．（口：ｎａｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏ－
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５～１．０ｘ１０‘ｍｏｌ・Ｌ。的条件Ｆ测定ｒ胶乳一抗体蛋 ７．ｏ）缓冲液进行稀释．使得抗体蛋
白复合物ｔｆ，抗体蛋自的表面筑水指教的变化情况．每个样品 用０．０１
ｍｏｌ・Ｌ’ＰＢ（ｐＨ
自的浓度范啁在０．０１～ｏ．４ ｍｇ・ｍＬ’．每个蛋白浓度下的 荧光强度差藏未添加ＡＮＳ窄ｒｌ样品的荧光强度得到蛋白的 相对荧光强度．以荧光强度对蛋白质浓度作图．初始段的斜 率即为蛋白质分子的表面酸水住指散Ｓ０． １．７统计分析 所有实验均敷复３次．每次实验计算出平均值和标准 整．利用ＳＰＳＳ软件对所彳Ｉ．实验结果进｛ｉ方差分析以确定差
ｒｉｍ（狭缝５唧）进行发射波长扫描（３２０～４００
前．扣除空白缓冲液背景并校正．用０．０１ 抗体胶乳徽球浓度调整为２Ｘ 体系的ｐＨ值为３．ｏ～９．０． １．５外蠢荧光光膏分析
ｒｉｍ）．每次测量
１
ｍｏｌ・Ｌ
ＰＢＳ将
１０ ５～１．０×１０样品溶液中，振荡．遘光静
欢１，郭
５１０６４０ ５１０６４０
丞１
摘要利用共价偶联的方法制备了胶乳一抗体蛋白复合物，并采用荧光光谱法对复合物的性质进行了研 究，以揭示胶乳微球与抗体蛋白之间的相互作用机理。内源荧光光谱分析结果表明，共价偶联后，抗体蛋白 的最大发射峰发生显著蓝移，最大发射峰强度显著降低，抗体蛋白的三级结构发生了一定的变化，胶乳微球 与抗体蛋白之间的相互作用对抗体蛋白的内源荧光有显著的猝灭作用，猝灭效果随着偶联体系ｐＨ值以及 胶乳浓度的增加而增强，猝灭机制为静态猝灭。外源荧光光谱分析结果表明，共价偶联后抗体蛋白的最大发 射峰强度显著增强，且随着偶联体系ｐＨ值的升高，抗体蛋白的疏水性显著降低，随着胶乳浓度的增加，疏 水性逐渐升高。 关键词胶乳一抗体蛋白复合物；抗体蛋白；荧光光谱 中图分类号：Ｑ７１ 文献标识码：Ａ ＤＯＩ：１０．３９６４／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００—０５９３（２０１２｝０８—２１６６—０５ 蛋白质之间相互作用的方法主要有：荧光光谱法、紫外一可见
２Ｘ１０—５ ｔｏ １．０×１０—４ ｍｏｌ・Ｌ一１）
ａｎｔｉｂｏｄｙ
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ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｌａｔｅｘ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｘ
免疫诊断中［１’２］。免疫诊断的理论基础是抗原与抗体间的特 异性反应［３］，当抗原／抗体连接在胶乳微球表面时，一旦抗 原／抗体与胶乳微球上的抗体／抗原发生特异性结合，由于胶 乳的凝聚作用，免疫反应从宏观上被放大了。所以将不同的 抗原／抗体连接在胶乳微球表面，通过免疫检测，可将一些 常见疾病，如肝炎、流感等快速检测出来。 常用的制备胶乳一抗体蛋白复合物的方法有两种：物理 吸附法和共价偶联法。由于吸附会引起固定于胶乳微球表面 蛋白的部分解吸及结构的变化，所以用物理吸附法制备的胶 乳一抗体蛋白复合物特异性低，在生物诊断中的应用受到限 制［４。６］。共价偶联法能在最大限度上控制吸附法中出现的问 题，成为目前制备胶乳一抗体蛋白复合物的主要方法。 在胶乳一抗体蛋白复合物的制备过程中，蛋白与胶乳微 球的相互作用总会存在，而这些相互作用会对固定于胶乳微 球表面抗体蛋白的功能特性、空间结构、生物活性及其在生 物诊断中的应用产生一定的影响，所以研究它们之间相互作 用的机理以及这些相互作用对胶乳一抗体蛋白复合物中抗体 蛋白性质的影响显得意义重大。近年来，常用于研究微球与
收稿日期：２０１２—０２—２３。修订日期：２０１２
０６—１０
１实验部分
１．１材料与试剂 胶乳微球（粒径２２０ ｎｍ），德国莫克公司；ＨＣＧ－ａ单克 隆抗体，美国Ｓｉｇｍａ公司；１－乙基碳酰二亚胺盐酸盐（ＥＤＣ）， Ｎ－羟基琥珀酰亚胺（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ），均为美国赛默飞世尔科技 公司；１一苯胺基萘一８一硝基苯甲酸盐（ＡＮＳ），美国Ｓｉｇｍａ公 司；其余化学试剂均为分析纯；实验用水为去离子水。 １．２主要仪器 超声波细胞粉碎机（ＪＹ－９２ＩＩ型），宁波新芝生物科技股 份公司；荧光光谱仪（Ｆ－４５００），日本Ｈｉｔａｃｈｉ Ｋｏｋｉ公司。 １．３胶乳一抗体蛋白复合物的制备
引
言
近年来，包被有抗体／抗原的胶乳微球已被广泛应用于
光谱法（ＵＶ－Ｖｉｓ）、圆二色谱法（ｃＤ）、傅里叶变换红外光谱 法（ＦＴＩＲ）及核磁共振法（ＮＭＲ）［７。１…。然而，在这些方法中， 荧光光谱法被认为是一种最简单、最有效的研究微球与蛋白 质问相互作用的方法［１１’１２Ｊ。 利用共价偶联法制备了胶乳一抗体蛋白复合物，并且采 用荧光光谱法研究了胶乳微球与抗体蛋白间的相互作用以及 相互作用对抗体蛋白结构性质的影响，以期为胶乳一抗体蛋 白复合物在生物诊断中的应用提供理论基础。
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胶乳－抗体■白复合铀的内｜荧光光谱分析 荧光光谱能够提供蛋门质分子中荧光生色摹团所处的徽
环境信息，进而得到鬣自质结构变化等有用信息【Ｉ。．有研究 表明．徽粒与蛋白质分子・｝，荧光基团之ｆＨ】的相互作用将会引 起峰强度．峰位移等荧光参散的变化．通过分析这些荧光参 数的变化能获得荧光甚团所处的傲环境及其与徽球问相互作 用的规律等信息［１钆“’．色氰酸．隧氮酸和笨丙氰酸为蛋白质 的三种内荧光基圃．赋ｆ ｒ蛋白质的荧光特性．其中色氨馥 被认为是埘环境变化置为敏感的氨基艘ｆｌ”．所以本研究通 过测定胶乳・抗体蛋白复合物中抗体蛋臼上色氨酸的荧光发 射光谱．探索抗体蛋ｆＩ结构性质的变化以及抗体蛋白与胶乳
ｍｉｎ ｐＬ
ＨＣＧ抗体（１０ ｍｇ・ｍＩ．１）加入到ｌ ｍＬ经过活
０００
ｒ・
化的胶乳徽球溶液ｔ｝，．熏沮下沮和搅拌４ ｈ．１０
１离心１５ ｍｉｎ．沉淀ｊ｝ｊ含０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０的ＰＢＳ（ｏ．１
ｍｏｌ・Ｉ．’）重复清洗三追．然后用０．１ ｍｏｌ・Ｌ＿１礴酸缓冲液 （ＰＩ垮）复溶．即得到胶乳一抗体蛋白复合物溶液． Ｉ．４内｜荧光光谱分析 荧光光谱的测定参照文献［１３］完成．在激发波长为２９５
ｒ
６．０的乙磺艘缓冲液（ＭＥＳ）均匀混合后加入Ⅱ℃和
ｍｉｎ．１０ ０００ ０．１ ｍｏｌ・Ｌ
ＳｕｌｂＮＨＳ各５ ｍｇ活化．窜沮下沮和搅拌１５
ｒ・ｒａｉｎｌ离心１５ ｍｉｎ．Ｊ｝１
１磷酸缓冲液（ＰＢＳ）重
复清洗沉淀Ｅ追．上Ｉ：清．沉淀经０．１ ｍｏｌ・１．。ＰＢＳ霞悬、 振荡、超声处理后即得到活化的胶乳徽球． 取４０
基金项目：国家科技部（８６３计划）项目（２０１０ＡＡ０２２８０２）和国家自然科学基金项目（３１０７１５６４）资助 作者简介：俞思明，１９８５年生，华南理工大学轻工与食品学院硕士研究生 ＊通讯联系人
ｅ－ｍａｉｌ：ＰＹＰ＠ｗｏｎｄｆｏ．ｃｏｉＴｌ，．ｃａ ｅ－ｍａｉｌ：ｔａｙｉｙａ＠１２６．ｃｏｒｎ
万方数据
根据式（１）．计算出，￡物火分子的荧光猝灭常敷Ｋ。值的范嘲 １．远远大于ｆｌ】动态碰掩机制得到的
ｒｏ值（２．０×１０”Ｍ‘・Ｓ’）．实验ｌ｛Ｉ的荧光猝火并非由动态 碰撞所引起．而是形成ｒ肇态荧光旌闭复合物（胶乳一抗体蛋 白复合物）而产，Ｅ的静态猝火．
４列
异显著性（ｐ＜ｏ．０５）．
ｊ训
２结果与讨论
２．Ｉ
第８期 取０．１ ｍＬ红色胶乳傲球．加入０．９
ｐＨ
光游学与光谱分折
ｍＬ．０．１ ｍｏｌ・Ｌ．
２１６７
徽球问的相吃作用。 图ｌ给ｆｌ｛了小ｌ‘习的ｐＨ侦条件下．胶乳一抗体蛋ｒＩ复合物 的内源荧光光潜图。由图ｌ ｌＩ『以发现．抗体蛋１．１的最大发射 峰显著蓝移（约１５ ｒｉｍ）ｔ同时．抗体蛋门的最大发射峰强度 也显著降低．Ｈ随着ｐＨ优的升高而逐渐降低。嘲２给｛ｌ｛ｒ 不同胶乳徽球浓度条件下．胶乳一抗体蛋Ｉ『Ｉ复合物的内源荧 光光谱图．‘ｊ图ｌ的趋势类似．抗体蛋ｒＩ的最大发射峰娃篇 蓝移．Ｈ抗体蛋ＩＪＩ的最大发射峰强度也娃并降低．随着胶乳 徽球浓度的升高呵逐渐降低． 研究结果表明［１“”：．蛀大发射峰位移的变化¨，以挺供 荧光基团所处徽环境附近饭性变化的取要ｆ．Ｉｆ息．蓝移说明蛋 白质的三级结构发生ｒ一定的变化．Ｊ￡色氮酸残基处于一个 更为琉水的徽环境巾・而红移意味肴色氰馥残纂更加孽露于 周围溶荆中．抗体蛋白的最大发射峰硅并篮移．说明抗体蛋 白的三级结构发生了一定变化．其分子卜的氨纂酸残肇处于 一种更为疏水的环境‘１１．Ｍｏｎｉｃａｍ报通ｒ类似的研究结聚。 除ｒ显著的蓝移．荧光猝火作用也张常明显．彳Ｉ．研究表 明㈣’２１］纳米傲球与蛋自伽的棚￡￡作用对蛋ｒＩ质的内源荧光 有显著的猝灭作用．猝火效粜・ｊ纳米徽球的大小和浓度彳ｆ 关．因此可以通过研究荧光猝火作Ｊ｝Ｊ束揭爪纳米徽球‘ｊ蛋Ｉ。Ｉ 质问的相瓯作用．荧光猝火效粜ｌ叮以ＪｌＩ Ｓｔｅｒｎ－Ｖｏｌｍｅｒ方程式 来描述