胶乳微球与抗体蛋白相互作用机理的荧光光谱法分析

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Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ／ｎｍ Ｆｉｇ．２ Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｆｌｕｏｒｃｓ∞ｎｒｅ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｌａｔｅｘ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌａｔｅｘ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．（口：ｎａｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏ－
根据式（１）．计算出，￡物火分子的荧光猝灭常敷Ｋ。值的范嘲 １．远远大于ｆｌ】动态碰掩机制得到的
ｒｏ值（２．０×１０”Ｍ‘・Ｓ’）．实验ｌ｛Ｉ的荧光猝火并非由动态 碰撞所引起．而是形成ｒ肇态荧光旌闭复合物（胶乳一抗体蛋 白复合物）而产，Ｅ的静态猝火．
４列
异显著性（ｐ＜ｏ．０５）．
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２结果与讨论
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摘要利用共价偶联的方法制备了胶乳一抗体蛋白复合物，并采用荧光光谱法对复合物的性质进行了研 究，以揭示胶乳微球与抗体蛋白之间的相互作用机理。内源荧光光谱分析结果表明，共价偶联后，抗体蛋白 的最大发射峰发生显著蓝移，最大发射峰强度显著降低，抗体蛋白的三级结构发生了一定的变化，胶乳微球 与抗体蛋白之间的相互作用对抗体蛋白的内源荧光有显著的猝灭作用，猝灭效果随着偶联体系ｐＨ值以及 胶乳浓度的增加而增强，猝灭机制为静态猝灭。外源荧光光谱分析结果表明，共价偶联后抗体蛋白的最大发 射峰强度显著增强，且随着偶联体系ｐＨ值的升高，抗体蛋白的疏水性显著降低，随着胶乳浓度的增加，疏 水性逐渐升高。 关键词胶乳一抗体蛋白复合物；抗体蛋白；荧光光谱 中图分类号：Ｑ７１ 文献标识码：Ａ ＤＯＩ：１０．３９６４／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００—０５９３（２０１２｝０８—２１６６—０５ 蛋白质之间相互作用的方法主要有：荧光光谱法、紫外一可见
置１５
ｍｉｎ．然后在激发波长ｋ＝３９０ ｎｌｎ．发射波长ｋ＝４７０
ｎｉｎ条件下测定样矗矗的荧光盥度．发射波长的范围为４００～
６００姗．每次测量时．用空白缓冲液扣除背景并校正．
１．６裹面蠢水指ｔ（Ｓ ｌ的奠定 利用ＡＮＳ作为荧光探针测定胶乳一抗体蛋白复合物中抗 体蛋白的表面琉水指数（Ｓ）．在ｐＨ ３．０～９．０．胶乳浓度２
引
言
近年来，包被有抗体／抗原的胶乳微球已被广泛应用于
光谱法（ＵＶ－Ｖｉｓ）、圆二色谱法（ｃＤ）、傅里叶变换红外光谱 法（ＦＴＩＲ）及核磁共振法（ＮＭＲ）［７。１…。然而，在这些方法中， 荧光光谱法被认为是一种最简单、最有效的研究微球与蛋白 质问相互作用的方法［１１’１２Ｊ。 利用共价偶联法制备了胶乳一抗体蛋白复合物，并且采 用荧光光谱法研究了胶乳微球与抗体蛋白间的相互作用以及 相互作用对抗体蛋白结构性质的影响，以期为胶乳一抗体蛋 白复合物在生物诊断中的应用提供理论基础。
收稿日期：２０１２—０２—２３。修订日期：２０１２
０６—１０
１实验部分
１．１材料与试剂 胶乳微球（粒径２２０ ｎｍ），德国莫克公司；ＨＣＧ－ａ单克 隆抗体，美国Ｓｉｇｍａ公司；１－乙基碳酰二亚胺盐酸盐（ＥＤＣ）， Ｎ－羟基琥珀酰亚胺（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ），均为美国赛默飞世尔科技 公司；１一苯胺基萘一８一硝基苯甲酸盐（ＡＮＳ），美国Ｓｉｇｍａ公 司；其余化学试剂均为分析纯；实验用水为去离子水。 １．２主要仪器 超声波细胞粉碎机（ＪＹ－９２ＩＩ型），宁波新芝生物科技股 份公司；荧光光谱仪（Ｆ－４５００），日本Ｈｉｔａｃｈｉ Ｋｏｋｉ公司。 １．３胶乳一抗体蛋白复合物的制备
ｍｉｎ ｐＬ
ＨＣＧ抗体（１０ ｍｇ・ｍＩ．１）加入到ｌ ｍＬ经过活
０００
ｒ・
化的胶乳徽球溶液ｔ｝，．熏沮下沮和搅拌４ ｈ．１０
１离心１５ ｍｉｎ．沉淀ｊ｝ｊ含０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０的ＰＢＳ（ｏ．１
ｍｏｌ・Ｉ．’）重复清洗三追．然后用０．１ ｍｏｌ・Ｌ＿１礴酸缓冲液 （ＰＩ垮）复溶．即得到胶乳一抗体蛋白复合物溶液． Ｉ．４内｜荧光光谱分析 荧光光谱的测定参照文献［１３］完成．在激发波长为２９５
基金项目：国家科技部（８６３计划）项目（２０１０ＡＡ０２２８０２）和国家自然科学基金项目（３１０７１５６４）资助 作者简介：俞思明，１９８５年生，华南理工大学轻工与食品学院硕士研究生 ＊通讯联系人
ｅ－ｍａｉｌ：ＰＹＰ＠ｗｏｎｄｆｏ．ｃｏｉＴｌ，．ｃａ ｅ－ｍａｉｌ：ｔａｙｉｙａ＠１２６．ｃｏｒｎ
万方数据
ｌ州ｌｅｘ－ｍｌｉｂｏ（１ｙ伽巾ｐ．ｃｘ ｗｉ恤
ｐＨ
ｆｒｏｍ ３．０¨９．Ｏ）
万方数据
２１６８
光谱学与光谱分析
第３２卷
体பைடு நூலகம்白复合物的外源荧光光谱。由图４可以看出．随着胶乳 浓度的增大，抗体蛋白的最大发射峰强度逐渐增大，这意味 着抗体蛋白的疏水性存在一定的改变。
７∞ ６∞ ５∞ ｊ．一、苦一∞ｃ３口一ｏｕ口Ｑ３ｌ－ｐｏｊ＿．Ｔ ４∞ ３∞ ３２０ ３４０ ３６０ ３８０ ２∞
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胶乳－抗体■白复合铀的内｜荧光光谱分析 荧光光谱能够提供蛋门质分子中荧光生色摹团所处的徽
环境信息，进而得到鬣自质结构变化等有用信息【Ｉ。．有研究 表明．徽粒与蛋白质分子・｝，荧光基团之ｆＨ】的相互作用将会引 起峰强度．峰位移等荧光参散的变化．通过分析这些荧光参 数的变化能获得荧光甚团所处的傲环境及其与徽球问相互作 用的规律等信息［１钆“’．色氰酸．隧氮酸和笨丙氰酸为蛋白质 的三种内荧光基圃．赋ｆ ｒ蛋白质的荧光特性．其中色氨馥 被认为是埘环境变化置为敏感的氨基艘ｆｌ”．所以本研究通 过测定胶乳・抗体蛋白复合物中抗体蛋臼上色氨酸的荧光发 射光谱．探索抗体蛋ｆＩ结构性质的变化以及抗体蛋白与胶乳
２Ｘ１０—５ ｔｏ １．０×１０—４ ｍｏｌ・Ｌ一１）
ａｎｔｉｂｏｄｙ
ｐｒｏ－
Ｓｔｅｒｎ－Ｖｏｈｎｅｒ
ｃｏｎｓｔａｎｔ酶ｉｎ
Ｋｓｖ／（ｍｏ卜Ｌ一１）
４．１４×１０ｓ士Ｏ．１２×１０ｓ ５．４０×１０５土０．０５×１０５ ８．３３×１０ｓ±０．０１×１０ｓ
ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｌａｔｅｘ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｘ
，．时吾Ｉｓ口廿＿置Ｄｏ口Ｑｕ２０，一山
ｌ
∞
０ ４２０ ４４０ ４６０ ４８０ ５００ ５２０ ５４０ ５６０ ５８０
Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ／ｎｍ Ｆｉｇ．４ Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ
ｔｅｉｎ；６～，：ｆｒｏｍ
Ｔａｂｌｅ １
１・Ｓ
ｓ．
５～１．０ｘ１０‘ｍｏｌ・Ｌ。的条件Ｆ测定ｒ胶乳一抗体蛋 ７．ｏ）缓冲液进行稀释．使得抗体蛋
白复合物ｔｆ，抗体蛋自的表面筑水指教的变化情况．每个样品 用０．０１
ｍｏｌ・Ｌ’ＰＢ（ｐＨ
自的浓度范啁在０．０１～ｏ．４ ｍｇ・ｍＬ’．每个蛋白浓度下的 荧光强度差藏未添加ＡＮＳ窄ｒｌ样品的荧光强度得到蛋白的 相对荧光强度．以荧光强度对蛋白质浓度作图．初始段的斜 率即为蛋白质分子的表面酸水住指散Ｓ０． １．７统计分析 所有实验均敷复３次．每次实验计算出平均值和标准 整．利用ＳＰＳＳ软件对所彳Ｉ．实验结果进｛ｉ方差分析以确定差
ｒ
６．０的乙磺艘缓冲液（ＭＥＳ）均匀混合后加入Ⅱ℃和
ｍｉｎ．１０ ０００ ０．１ ｍｏｌ・Ｌ
ＳｕｌｂＮＨＳ各５ ｍｇ活化．窜沮下沮和搅拌１５
ｒ・ｒａｉｎｌ离心１５ ｍｉｎ．Ｊ｝１
１磷酸缓冲液（ＰＢＳ）重
复清洗沉淀Ｅ追．上Ｉ：清．沉淀经０．１ ｍｏｌ・１．。ＰＢＳ霞悬、 振荡、超声处理后即得到活化的胶乳徽球． 取４０
ｒｉｍ（狭缝５唧）进行发射波长扫描（３２０～４００
前．扣除空白缓冲液背景并校正．用０．０１ 抗体胶乳徽球浓度调整为２Ｘ 体系的ｐＨ值为３．ｏ～９．０． １．５外蠢荧光光膏分析
ｒｉｍ）．每次测量
１
ｍｏｌ・Ｌ
ＰＢＳ将
１０ ５～１．０×１０‘ｍｏｌ・Ｌ‘．
将ｌｏ ｔＡ．ＡＮＳ加入到２“。样品溶液中，振荡．遘光静
ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌａｔｅｘ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（ｎ～ｅ：ｆｒｏｍ ２×１０－５
ｔｏ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｌａｔｅｘ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
Ｌａｔｅｘ
ｌＯ－４ ｍｏｌ・Ｌ＿１）
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／（ｍｏ卜Ｌ一１）
２×１０－５ ４×１０－ｓ ６×１０ ８Ｘ１０
第３２卷，第８期 ２ ０ ｌ ２年８月
光谱学与光谱分析
Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｖ０１．３２，Ｎｏ．８，ｐｐ２１６６—２１７０ Ａｕｇｕｓｔ，２０１２
胶乳微球与抗体蛋白相互作用机理的荧光光谱法分析
俞思明１，彭运平１’孙，于淑娟１，吕
１．华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 ２．广州万孚生物技术有限公司，广东广州
ｘｌｏ
警＝ｌ＋Ｋ。ｒｏ［Ｑｊ＝Ｊｆ（ｎｔＬＱＪ
Ｊ
（１）
这艰的Ｆｏ和Ｆ分别足钉、尤猝火刺时的荧光强度．Ｋ。 为生物分子的猝灭常数．ｒｏ为尤猝火删时荧光团的寿命伉． Ｋ．ｗ为Ｓｔｅｒｎ－Ｖｏｌｍｅｒ荧光猝灭常数．Ｑ为猝灭刺浓度．友ｌ的 给出了不同胶乳浓度下测定的Ｋ啸．伉。ＩｌＩ农ｌ呵以发现．随 着胶乳浓度的增大．Ｋｗ伉逐渐增大．农明猝火效果随将胶 乳浓度的增大增骰．对于乍物大分子．ｒｏ值大约为５×１０９ 为１０１２～ｌＯ¨Ｍ
第８期 取０．１ ｍＬ红色胶乳傲球．加入０．９
ｐＨ
光游学与光谱分折
ｍＬ．０．１ ｍｏｌ・Ｌ．
２１６７
徽球问的相吃作用。 图ｌ给ｆｌ｛了小ｌ‘习的ｐＨ侦条件下．胶乳一抗体蛋ｒＩ复合物 的内源荧光光潜图。由图ｌ ｌＩ『以发现．抗体蛋１．１的最大发射 峰显著蓝移（约１５ ｒｉｍ）ｔ同时．抗体蛋门的最大发射峰强度 也显著降低．Ｈ随着ｐＨ优的升高而逐渐降低。嘲２给｛ｌ｛ｒ 不同胶乳徽球浓度条件下．胶乳一抗体蛋Ｉ『Ｉ复合物的内源荧 光光谱图．‘ｊ图ｌ的趋势类似．抗体蛋ｒＩ的最大发射峰娃篇 蓝移．Ｈ抗体蛋ＩＪＩ的最大发射峰强度也娃并降低．随着胶乳 徽球浓度的升高呵逐渐降低． 研究结果表明［１“”：．蛀大发射峰位移的变化¨，以挺供 荧光基团所处徽环境附近饭性变化的取要ｆ．Ｉｆ息．蓝移说明蛋 白质的三级结构发生ｒ一定的变化．Ｊ￡色氮酸残基处于一个 更为琉水的徽环境巾・而红移意味肴色氰馥残纂更加孽露于 周围溶荆中．抗体蛋白的最大发射峰硅并篮移．说明抗体蛋 白的三级结构发生了一定变化．其分子卜的氨纂酸残肇处于 一种更为疏水的环境‘１１．Ｍｏｎｉｃａｍ报通ｒ类似的研究结聚。 除ｒ显著的蓝移．荧光猝火作用也张常明显．彳Ｉ．研究表 明㈣’２１］纳米傲球与蛋自伽的棚￡￡作用对蛋ｒＩ质的内源荧光 有显著的猝灭作用．猝火效粜・ｊ纳米徽球的大小和浓度彳ｆ 关．因此可以通过研究荧光猝火作Ｊ｝Ｊ束揭爪纳米徽球‘ｊ蛋Ｉ。Ｉ 质问的相瓯作用．荧光猝火效粜ｌ叮以ＪｌＩ Ｓｔｅｒｎ－Ｖｏｌｍｅｒ方程式 来描述
免疫诊断中［１’２］。免疫诊断的理论基础是抗原与抗体间的特 异性反应［３］，当抗原／抗体连接在胶乳微球表面时，一旦抗 原／抗体与胶乳微球上的抗体／抗原发生特异性结合，由于胶 乳的凝聚作用，免疫反应从宏观上被放大了。所以将不同的 抗原／抗体连接在胶乳微球表面，通过免疫检测，可将一些 常见疾病，如肝炎、流感等快速检测出来。 常用的制备胶乳一抗体蛋白复合物的方法有两种：物理 吸附法和共价偶联法。由于吸附会引起固定于胶乳微球表面 蛋白的部分解吸及结构的变化，所以用物理吸附法制备的胶 乳一抗体蛋白复合物特异性低，在生物诊断中的应用受到限 制［４。６］。共价偶联法能在最大限度上控制吸附法中出现的问 题，成为目前制备胶乳一抗体蛋白复合物的主要方法。 在胶乳一抗体蛋白复合物的制备过程中，蛋白与胶乳微 球的相互作用总会存在，而这些相互作用会对固定于胶乳微 球表面抗体蛋白的功能特性、空间结构、生物活性及其在生 物诊断中的应用产生一定的影响，所以研究它们之间相互作 用的机理以及这些相互作用对胶乳一抗体蛋白复合物中抗体 蛋白性质的影响显得意义重大。近年来，常用于研究微球与