引物保护碱基列表格

11月13日
引物合成的详解需要什么级其余引物？
答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。

依据实验需要，确立订购引物的纯度级别。

应用引物长度要求
纯度级别要求
一般PCR扩增<45base OPC
一般PCR扩增>45base PAGE
诊疗PCR扩增<40base OPC,PAGE DNA测序20base左右OPC
亚克隆，点突变等
依据实验要求
定
OPC,PAGE，
HPLC
基因建立（全基因合成）
依据实验要求
定PAGE
反义核酸
依据实验要求
定PAGE
修饰引物
依据实验要求
定
PAGE,HPLC
怎样计算引物的浓度？
答：引物保留在高浓度的状况下比较稳固。

引物一般配制成
10-50pmol/ul。

一般状况下，建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，
加水的体积（微升）按以下方式计算：V(微升)=OD数*（乘）33*（乘）
（乘）20000/(除)引物的分子量。

引物的分子量能够从合成报告单上获取。

假如需要配制成其余浓度，按上述公式换算。

注意：1OD260=33ug/ml.怎样计算引物的Tm值？
答：引物设计软件都能够给出Tm，与引物长度、碱基构成、引物使用缓冲的离子强度有关。

长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm=4℃(G+
C)+2℃(A+T)
关于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
Tm=+xLog10[Na+]+(%GC)–600/size
公式中，Size=引物长度。

怎样溶解引物？
答：干燥后的引物质地特别松散，开盖前最好离心一下，或管垂直向上
在桌面上敲敲，将引物粉末采集到管底。

依据计算出的体积加入去离子无菌水或10mMTris缓冲液，室温搁置几分钟，振荡助溶，离心将溶液采集到管底。

溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这类条件下不稳固。

怎样保留引物？
答：引物合成后，经过一系列办理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。

引物在溶解前，室温状态下能够长久保留。

溶解后的引物-20度能够长久保留。

假如对实验的重复
性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，防止频频冻融。

修饰荧光引物需要避光保留。

合成的引物5’端能否有磷酸化
答：合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。

假如需要您能够用多核苷
酸激酶进行5′端磷酸化，或许要求引物合成企业合成时直接在5′或
3′端进行磷酸化，需要此外收费。

引物片段退火后不可以连结到载体上是什么问题？
连结反响需要引物的5’磷酸基团。

假如需要将合成的引物退火直接连
接相应的载体上，引物需要磷酸化。

磷酸化的产物假如还不可以连结载体
上，需要检查载体的酶切成效，需要改良引物退火的条件。

SiRNA分子拥有特别的对称构造，退火的难度较大，退火时需要提升退火温度。

长链引物为何犯错的几率特别高？
答：引物合成时，每一步反响效率都不可以达到100%，产生碱基插入、缺失、置换突变的要素客观条件都有向来存在。

引物链越长，突变的频次
累加起来就越高。

研究人员总希望合成的引物十拿九稳，这类心情能够理解。

可是如同PCR扩增，不行能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不行能保证100%正确。

要知道，引物合成中发生错误（非人为要素）的频次，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频次都要高。

做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。

TaqMan探针设计的基来源则是什么？答：以下原则供您参照。

◆TaqMan探针地点尽可能凑近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不可以与引物重叠。

◆长度一般为18-40mer。

◆G-C含量控制在40-80%左右。

◆防止连续相同碱基的出现，特别是要防止GGGG或更多G出现。

◆在引物的5’端防止使用G。

◆采纳比许多的碱基C。

◆退火温度Tm控制在68-70C左右。

实用的荧光染料参数
Name汲
取波长
发射
波长
c
olor
s
6-FAM（6-carboxy-fluorescein）
494
nm
518n
m
G
reen
TET（5-
tetrachloro-
fluorescein）
521
nm
538n
m
O
range
HEX（5-hexachloro-fluorescein）
535
nm
553n
m
P
ink
TAMRA（tetramethyl-6-carboxyrhodamine
）
560nm
582n
m
R
ose
ROX（6-carboxy-x-rhodamine）
587
nm
607n
m
R
ed
Cy3
（Indodicarbocyani
ne）
552
nm
570n
m
R
ed
Cy5
（Indodicarbocyani
ne）
643
nm
667n
m
V
iole
t
设计的基来源则是什么？答：引物设计的以下原则供您参照。

◆引物长度一般在18-35mer。

◆G-C含量控制在40-60%左右。

◆防止近3’端有酶切位点或发夹构造。

◆假如可能防止在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。

◆假如可能防止在3’端最后1个碱基为A。

◆防止连续相同碱基的出现，特别是要防止GGGG或更多G出现。

◆退火温度Tm控制在58-60C左右。

◆假如是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。

21.为何引物的OD260/OD280小于？
答：引物应当全部是DNA，可是OD260/OD280的比值为何那么低，怎么
会有蛋白质污染？引物化学合成，哪里有时机污染到蛋白质？需要指出的是OD260/OD280的比值不可以用来权衡引物的纯度。

OD260/OD280的比值过低一般是因为引物中C/T的含量比较高所致。

下表是一个20mer同
聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表示OD260/OD280的比值与引物的碱基构成亲密有关。

A260/280ratiosofCrude20-merOligosofDifferingBase
Compositions
BaseComposition
A2 60/280
5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-35-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-35-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-35-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-35-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3相同的OD用PAGE检测，EB染色为何深浅不一？
答：往常能够用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，因为
EB能够嵌合到双链DNA中。

而合成的单链DNA，因为碱基构成不一样，形成二级构造的可能性不一样，EB的染色程度也会有差别，比方Oligo(dT)等不形成二级构造，EB染色成效就特别差。

因此不要用EB染色的方法
来定量，而用紫外分光光度计检测。

相同道理，用EB染色来照片不适
合全部引物。

引物不纯会有什么结果？
答：引物不纯可能会致使：1)非特异性扩增；2)没法用早先设计在引物
5′端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物；3)用于测序出
现双峰或乱峰。

解决方法从头合成或从头纯化。

已经溶解的引物，为何原来使用正常，而过一段时间再使用就不好了？
答：假如溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。

使用时没有充足解冻混淆，液体不平均也可能会造成引物加入量禁止
确。

建议分装引物，防止频频冻溶。

建议使用10mMTris缓冲液
溶解引物，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这类条件下不稳固。

还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用资料特别是模板的质量与先前使用的不完整一致。

扩增不出就引物有问题吗？
答：基本不是。

现在发展出各色各种的PCR扩增技术，各色各种的高温聚合酶，就是来解决PCR扩增中碰到的扩不出、扩增效率低的问题。

如巢式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。

有些重复片段的扩增, GC含量高的片段，非要采纳特别扩增手段才能扩增出了。

引物扩增不出，主假如以下两种状况比较常有（1）RT-PCR。

请注意，好多基因经过惯例RT–PCR方法是很难扩增出来的。

RT-PCR成功的重点在于RT的反响的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。

2）从基因组中扩增。

一般状况下，基因在基因组中都是单拷贝，基
因组作为模板需要严格控制用量。

基因组DNA过高，会影响反响系统中的Mg和pH。

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保护碱基列表
Enzyme OligoSequence
Chai
n
%Cleav
age
Leng
th
2
hr
2
0hr
AccI GGTCGAC800
CGGTCGAC1000
CCGTCGACCGG1200 AflIII CACATGT800
CCACATGTGG10
>
90
>
90
CCCACATGTGGG12
>
90
>
90
AscI GGCGCGCC8
>9
>
90
AGGCGCGCCT10
>9
>
90
TTGGCGCGCCAA12
>9
>
90
AvaI CCCCGGG850
> 90
CCCCCGGG10
>9
>
90
TCCCCCGGGGGA12
>9
>
90
BamHI CGGATCC810
2 5
CGGGATCCCG10
>9
>
90
CGCGGATCCGCG12
>9
>
90
BglII CAGATCT800
GAAGATCTTC1075
> 90
GGAGATCTTCC1225
> 90
BssHI
I GGCGCGC800
AGGCGCGCCT1000
TTGGCGCGCCAA1250
> 90
BstEI
I GGGT(A/T)ACC90
1 0
BstXI AACTGCAGAACCAATGCATTGG2200
AAAACTGCAGCCAATGCATTGG2425
5 0
CTGCAGAACCAATGCATTGGCAT2725
>
90 ClaI CATCGAT800
GATCGAT800
CCATCGATGG10
>9
>
90
CCCATCGATGGG1250
5 0
EcoRI GGAATTC8
>9
>
90
CGGAATTCG10
>9
>
90
CCGAATTCGG12
>9
>
90
HaeII
I GGGGCCC8
>9
>
90
AGCGGCCGCT10
>9
>
90
TTGCGGCCGCAA12
>9
>
90
HindI
II CAAGCTT800
CCAAGCTTGG1000
CCCAAGCTTGGG1210
7 5
KpnI GGGTACC800
GGGGTACC10
>9
>
90
CGGGTACCCCG12
>9
>
90
MluI GACGCGT800
CGACGCGT1025
5 0
NcoI CCCATGG800
7
5
CATGCCATGGCATG1450
Nde
I CCATATG800
CCCATATGG
1
000
CGCATATGCG
1
200
GGGTTTCATATGAAACCC
1
800
GGAATTCCATATGAATTCC
2
075
>
90
GGGAATTCCATATGAATTCCC
2
275
>
90
Nhe
I GGCTAGC800
CGGCTAGCCG
1
010
2
5
CTAGCTAGCTAG
1
210
5
Not
I TTGCGGCCGCAA
1
200
ATTTGCGGCCGCTTTA
1
610
1
AAATATGCGGCCGCTATAAA
2
010
1
ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT
2
425
9
AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA
2
825
>
90
Nsi
I TGCATGCATGCA
1
210
>
90
CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT
2
2
>9
>
90
Pac
I TTAATTAA800
GTTAATTAAC
10
2
05
CCTTAATTAAGG
1
20
>
90
Pme
I GTTTAAAC800
GGTTTAAAC
1
00
2
5
GGGTTTAAACCC
1
20
5
AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG
2
475
>
90
Pst
I GCTGCAG800
TGCACTGCAGTGCA
1
410
1
AACTGCAGAACCAATGCATTGG
2
2
>9
>
90
AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA
2
4
>9
>
90
CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
2
600
Pvu
I CCGATCG800
ATCGATCG
1
010
2
5
TCGCGATCGCGA
1
20
1
Sac
I CGAGCTC810
1 0
Sac
II GCCGCGG800
TCCCCGCGGGGA
1
250
>
90
Sal
I GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC2800
GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG3010
5 0
ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA3210
7 5
Sca
I GAGTACT810
2 5
AAAAGTACTTTT
1
275
7
5
Sma
I CCCGGG60
1 0
CCCCGGG80
1 0
CCCCCGGG
1
010
5
TCCCCCGGGGGA12>90>90
SpeI GACTAGT810
> 90
GGACTAGTCC1010
> 90
CGGACTAGTCCG120
5 0
CTAGACTAGTCTAG140
5 0
SphI GGCATGC800
CATGCATGCATG120
2 5
ACATGCATGCATGT1410
5 0
StuI AAGGCCT8
>9
>
90
GAAGGCCTTC10
>9
>
90
AAAAGGCCTTTT12
>9
>
90
XbaI CTCTAGA800
GCTCTAGAGC10
>9
>
90
TGCTCTAGAGCA1275
> 90
CTAGTCTAGACTAG1475
> 90
XhoI CCTCGAG800
CCCTCGAGGG1010
2 5
CCGCTCGAGCGG1210
7 5
XmaI CCCCGGG800
CCCCCGGG1025
7 5
CCCCCGGGGGG1250
> 90
TCCCCCGGGGGGA14
>9
>
90。