胶回收 PPT
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➢ 由于绑透析带很难操作，只有在回收非常大的片断时才 会考虑的。
➢ 丙烯酰胺电泳凝胶产物回收的方法之一。
12
2.1.5 DEAE纤维素膜纸片法
➢ 将DEAE纤维素膜裁成小条活化处理。电泳后在 目的条带前切一刀，将比条带略宽的DEAE 纤维 素膜插入切口，不留气泡，继续电泳，条带上的 DNA被膜片截留，取出膜片冲洗后转移到离心管 中加缓冲液65℃保温洗脱，直到膜上DNA被完 全洗脱，将溶液用酚氯仿抽提沉淀。
2
向吸附柱CA2中 加入μL漂洗液PW
12000rpm, 离心30~60sec
3
弃废液，将吸附 柱重新放回收集管 中。重复操作1,2,3
注：1.漂洗液PW使用前先检查是否已加入无水乙醇。 2.如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或
直接测序，建议PW加入后静置2~5min再离心。
25
4.1 实验流程
4.1.6 去除漂洗液
1
2
将吸附柱CA2放回 收集管中
12000rpm, 离心2min
3
将吸附柱CA2置于 室温放置数分钟，
晾干
注：1.尽量除尽漂洗液，以防止残留的漂洗液中的乙醇影响下一步的 实验（如酶切、PCR等）。
26
4.1 实验流程
4.1.7 收集DNA
1
2
将吸附柱CA2放到 一个干净离心管中
胶回收
目录
一 胶回收基础知识 二 方法及应用 三 试剂耗材与设备 四 操作流程 五 常见问题解答
目录
一 胶回收基础知识 二 方法及应用 三 试剂耗材与设备 四 操作流程 五 常见问题解答
1.胶回收的概念 2.胶回收的原理
1.1 胶回收概念
➢ 从电泳后的凝胶中回收目的DNA的过程，其目的 是将目标DNA重新利用。
5
电泳后 ，切下凝胶 称重后，加入等体积溶胶液 上柱吸附DNA
除胶 脱盐
洗脱
目录
一 胶回收基础知识 二 方法及应用 三 试剂耗材与设备 四 操作流程 五 常见问题解答
1.分类 2.应用
2.1 分类
7
2.1.1 硅胶柱法
➢ 采用可以高效、专一结合DNA的硅基质材料和独 特的缓冲液系统，从凝胶中回收DNA片段，同时 除去蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子等杂 质。
28
4.1 实验流程
不同浓度大小琼脂糖的有效分离范围
琼脂糖浓度（％） DNA有效分离范围（Kb）
0.5
30～1
0.7
12～0.8
1.0
10～0.5
1.2
7～0.4
1.5
3～0.2
29
4.1 实验流程
4.1.8 结果分析- 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶制作
上样
电泳
① 在锥形瓶中加入1mL 50xTAE 、 49mL蒸馏水、0.4g琼脂糖，混匀；
17
3.3 设备
离心机
水浴锅
18
3.3 设备
凝胶成像系统
水平电泳仪
19
目录
一 胶回收基础知识 二 方法及应用 三 试剂耗材与设备 四 操作流程 五 常见问题解答
1.实验流程 2.注意事项
4.1 实验流程
4.1.1 柱平衡步骤
1
2
向吸附柱CA2柱 加入500μL 平衡液BL
12000rpm, 离心1min
5 常见问题解答
37
5 常见问题解答
38
问题解答
胶回收标准实验流程－试剂耗材与设备
胶回收标准实验流程－实验流程
1
2
１柱平衡 步骤
向吸附柱 CA2柱 加入500μL 平衡液BL
12000rpm, 离心1min
２切胶
1
将目的条 带从琼脂糖 凝胶中切下
2
放入干净的 离心管中
3
弃废液，将 吸附柱重新放回
② 放入微波炉中加热，约煮沸三次，冷 却至不烫手；
③ 加入2.5μLNuclleic Acid Stain核酸 染料，轻轻摇匀，避免产生气泡，倒 入已垂直插好梳子的铺胶版中，待凝 固。
30
① 取 1μL 上 样 缓 冲 液 与 5μL 产 物混匀
② 垂直加入上样 孔中。
电泳条件： 140V， 20min。
1
2
将吸附柱CA2放到 一个干净离心管中
向吸附膜中间 位置悬空滴加适量 洗脱缓冲液EB，
室温放置2min
3
12000rpm, 离心2min 收集DNA溶液
７收集ＤＮＡ
胶回收标准实验流程－实验流程 ８结果分析
琼脂糖凝胶制作
上样
电泳
① 在锥形瓶中加入1mL 50xTAE 、 49mL蒸馏水、0.4g琼脂糖，混匀；
➢ 早期实验室最常用方法之一。 ➢ 这个方法不适合做较大的DNA，因为洗脱比较困
难。
13
2.2 应用ＤＮＡ连接筛选14目录一 胶回收基础知识 二 方法及应用 三 试剂耗材与设备 四 操作流程 五 常见问题解答
1.试剂 2.耗材 3.设备
3.1 试剂
16
3.2 耗材
➢ 各种规格移液枪、枪头 ➢ 离心管
4.2 结果分析—琼脂糖凝胶电泳
➢ 将电泳结束后的凝胶放在凝胶成像 系统中拍照保存。
➢ 对结果进行分析： ① 看有无目的带 ② 看是否存在非特异带 ③ 看条带亮度
31
切割 回收
4.2 注意事项
1.洗脱体积不应小于30μL，体积过少 影响回收效率。洗脱液的pH值对于 洗脱效率有很大影响。若后续做测序， 需使用ddH2O做洗脱液，并保证其 pH值在7.0~8.5范围内，pH值低于 7.0会降低洗脱效率。
10
2.1.3 低熔点琼脂糖法
➢ 传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶， 电泳后切割目的条带，在TE溶液中65℃保温融化， 用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。
➢ 这个方法需要用到酚氯仿等有机试剂，由于乙醇沉 淀需时较长，现已较少使用。
11
2.1.4 透析带电洗脱法
➢ 切下的条带放在充满TAE的透析带中电泳，让 DNA跑出 凝胶，跑向溶液中，再通过反向电泳，将附在透析带上 的DNA赶回溶液中，取溶液部分，再用TAE洗洗袋子， 合并溶液后传统方法酚抽沉淀。再次电泳后的胶通常还 要再染色看看残留。
➢ 最简单快速的回收方法。 ➢ 不适合用于大片断的回收。
8
大家学习辛苦了，还是要坚持
继续保持安静
2.1.2 玻璃奶/纯化填料法
玻璃奶/纯化 填料法
➢ 利用特殊玻璃微珠吸附DNA 的特性，根据每次回收实验 时预期回收量来调整纯化填 料的量，使得实验不受限于 柱子的载量，也不会造成浪 费。
➢ 适合各种不同大小的片断， 特别是大片断的回收。
切割 回收
Lane M:1kb DNA Marker Lane 1:胶回收前的2.7kb DNA段 Lane 2:胶回收后的2.7kb DNA段 切割Lane 1后，经处理回收DNA，经 电泳得到Lane 2。
4
1.2 胶回收原理
➢ 利用核酸在裂解 液下与硅胶膜吸 附柱特异性结合， 在洗脱液条件下 被洗脱，从而达 到核酸纯化回收 的目的。
至胶块完全溶解。
23
4.1 实验流程
4.1.4 吸附DNA
1
2
将所得溶液加入 一个吸附柱CA2中，
室温放置2min
12000rpm, 离心30~60sec
3
弃废液，将吸附柱 重新放回收集管中
注：吸附柱容积为800μL，若样品体积大于800μL可分批加入。
24
4.1 实验流程
4.1.5 洗去杂质
1
向吸附膜中间 位置悬空滴加适量 洗脱缓冲液EB，
室温放置2min
3
12000rpm, 离心2min 收集DNA溶液
27
4.1 实验流程
4.1.8 结果分析- 琼脂糖凝胶电泳
原理：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动称为电泳。 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。
５除杂质
1
向吸附柱CA2中 加入μL漂洗液PW
2
12000rpm, 离心30~60sec
3
弃废液，将吸 附柱重新放回收 集管中。重复操作
1,2,3
６去漂洗液
1
将吸附柱CA2 放回收集管中
2
12000rpm, 离心2min
3
将吸附柱CA2 置于室温放置数
分钟，晾干
胶回收标准实验流程－实验流程
７收集ＤＮＡ
32
4.2 注意事项
2.平衡液BL的加入能够改善吸附柱的吸 附能力并提高吸附柱的均一性和稳定性， 消除高温/潮湿或其他不良环境因素对吸 附柱造成的影响。使用前请先检查平衡 液BL是否出现浑浊，如有浑浊现象，可 在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄 清。
33
4.2 注意事项
3.电泳时最好使用新的电泳缓冲液，以免影响电 泳和回收效果。 4.如下一步实验要求较高，则应尽量使用TAE电泳 缓冲液。 ５.如果回收率较低，可在胶充分溶解后检测pH值， 如pH值大于7.5，可向含有DNA的胶溶液中加 10~30μL3M醋酸钠（pH5.2)将pH值调制5~7之 间。
3
弃废液，将吸附柱 重新放回收集管中
21
4.1 实验流目的条带从 琼脂糖凝胶中
切下
2
放入干净的 离心管中
3
称取重量
22
4.1 实验流程
4.1.3 溶胶
1
向胶块中加入 等体积溶液PN
2
50℃水浴，不 断温和地上下翻 转离心管，确保 胶块充分溶胶。
注：1.如果凝胶重0.1g，其体积可视为100μL，则加入100μL溶液PN。 2.若胶块未完全溶胶，可继续放置几分钟或补加一些溶胶液，直
34
4.2 注意事项
６.切胶是，紫外照射时间应尽量短，以免对 DNA造成损伤。 7.回收<100bp及>10kb的DNA片段时，应加 大溶胶液的体积，延长吸附和洗脱的时间。 8.回收率与初始DNA量和洗脱体积有关，初始 量越少、洗脱体积越少，回收率越低。
35
目录
一 胶回收基础知识 二 方法及应用 三 试剂耗材与设备 四 操作流程 五 常见问题解答
收集管中
3
称取重量
胶回收标准实验流程－实验流程
３溶胶
1
向胶块中加入 等体积溶液PN
2
50℃水浴，不 断温和地上下翻 转离心管，确保 胶块充分溶胶。
４吸附
1
将所得溶液加 入 一个吸附柱 CA2中，室温放
置2min
2
12000rpm, 离心30~60sec
3
弃废液，将吸 附柱重新放回收
集管中
胶回收标准实验流程－实验流程
② 放入微波炉中加热，约煮沸三次，冷 却至不烫手；
③ 加入2.5μLNuclleic Acid Stain核酸 染料，轻轻摇匀，避免产生气泡，倒 入已垂直插好梳子的铺胶版中，待凝 固。
① 取 1μL 上 样 缓 冲 液 与 5μL 产 物混匀
② 垂直加入上样 孔中。
电泳条件： 140V， 20min。
➢ 丙烯酰胺电泳凝胶产物回收的方法之一。
12
2.1.5 DEAE纤维素膜纸片法
➢ 将DEAE纤维素膜裁成小条活化处理。电泳后在 目的条带前切一刀，将比条带略宽的DEAE 纤维 素膜插入切口，不留气泡，继续电泳，条带上的 DNA被膜片截留，取出膜片冲洗后转移到离心管 中加缓冲液65℃保温洗脱，直到膜上DNA被完 全洗脱，将溶液用酚氯仿抽提沉淀。
2
向吸附柱CA2中 加入μL漂洗液PW
12000rpm, 离心30~60sec
3
弃废液，将吸附 柱重新放回收集管 中。重复操作1,2,3
注：1.漂洗液PW使用前先检查是否已加入无水乙醇。 2.如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或
直接测序，建议PW加入后静置2~5min再离心。
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4.1 实验流程
4.1.6 去除漂洗液
1
2
将吸附柱CA2放回 收集管中
12000rpm, 离心2min
3
将吸附柱CA2置于 室温放置数分钟，
晾干
注：1.尽量除尽漂洗液，以防止残留的漂洗液中的乙醇影响下一步的 实验（如酶切、PCR等）。
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4.1 实验流程
4.1.7 收集DNA
1
2
将吸附柱CA2放到 一个干净离心管中
胶回收
目录
一 胶回收基础知识 二 方法及应用 三 试剂耗材与设备 四 操作流程 五 常见问题解答
目录
一 胶回收基础知识 二 方法及应用 三 试剂耗材与设备 四 操作流程 五 常见问题解答
1.胶回收的概念 2.胶回收的原理
1.1 胶回收概念
➢ 从电泳后的凝胶中回收目的DNA的过程，其目的 是将目标DNA重新利用。
5
电泳后 ，切下凝胶 称重后，加入等体积溶胶液 上柱吸附DNA
除胶 脱盐
洗脱
目录
一 胶回收基础知识 二 方法及应用 三 试剂耗材与设备 四 操作流程 五 常见问题解答
1.分类 2.应用
2.1 分类
7
2.1.1 硅胶柱法
➢ 采用可以高效、专一结合DNA的硅基质材料和独 特的缓冲液系统，从凝胶中回收DNA片段，同时 除去蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子等杂 质。
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4.1 实验流程
不同浓度大小琼脂糖的有效分离范围
琼脂糖浓度（％） DNA有效分离范围（Kb）
0.5
30～1
0.7
12～0.8
1.0
10～0.5
1.2
7～0.4
1.5
3～0.2
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4.1 实验流程
4.1.8 结果分析- 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶制作
上样
电泳
① 在锥形瓶中加入1mL 50xTAE 、 49mL蒸馏水、0.4g琼脂糖，混匀；
17
3.3 设备
离心机
水浴锅
18
3.3 设备
凝胶成像系统
水平电泳仪
19
目录
一 胶回收基础知识 二 方法及应用 三 试剂耗材与设备 四 操作流程 五 常见问题解答
1.实验流程 2.注意事项
4.1 实验流程
4.1.1 柱平衡步骤
1
2
向吸附柱CA2柱 加入500μL 平衡液BL
12000rpm, 离心1min
5 常见问题解答
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5 常见问题解答
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问题解答
胶回收标准实验流程－试剂耗材与设备
胶回收标准实验流程－实验流程
1
2
１柱平衡 步骤
向吸附柱 CA2柱 加入500μL 平衡液BL
12000rpm, 离心1min
２切胶
1
将目的条 带从琼脂糖 凝胶中切下
2
放入干净的 离心管中
3
弃废液，将 吸附柱重新放回
② 放入微波炉中加热，约煮沸三次，冷 却至不烫手；
③ 加入2.5μLNuclleic Acid Stain核酸 染料，轻轻摇匀，避免产生气泡，倒 入已垂直插好梳子的铺胶版中，待凝 固。
30
① 取 1μL 上 样 缓 冲 液 与 5μL 产 物混匀
② 垂直加入上样 孔中。
电泳条件： 140V， 20min。
1
2
将吸附柱CA2放到 一个干净离心管中
向吸附膜中间 位置悬空滴加适量 洗脱缓冲液EB，
室温放置2min
3
12000rpm, 离心2min 收集DNA溶液
７收集ＤＮＡ
胶回收标准实验流程－实验流程 ８结果分析
琼脂糖凝胶制作
上样
电泳
① 在锥形瓶中加入1mL 50xTAE 、 49mL蒸馏水、0.4g琼脂糖，混匀；
➢ 早期实验室最常用方法之一。 ➢ 这个方法不适合做较大的DNA，因为洗脱比较困
难。
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2.2 应用ＤＮＡ连接筛选14目录一 胶回收基础知识 二 方法及应用 三 试剂耗材与设备 四 操作流程 五 常见问题解答
1.试剂 2.耗材 3.设备
3.1 试剂
16
3.2 耗材
➢ 各种规格移液枪、枪头 ➢ 离心管
4.2 结果分析—琼脂糖凝胶电泳
➢ 将电泳结束后的凝胶放在凝胶成像 系统中拍照保存。
➢ 对结果进行分析： ① 看有无目的带 ② 看是否存在非特异带 ③ 看条带亮度
31
切割 回收
4.2 注意事项
1.洗脱体积不应小于30μL，体积过少 影响回收效率。洗脱液的pH值对于 洗脱效率有很大影响。若后续做测序， 需使用ddH2O做洗脱液，并保证其 pH值在7.0~8.5范围内，pH值低于 7.0会降低洗脱效率。
10
2.1.3 低熔点琼脂糖法
➢ 传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶， 电泳后切割目的条带，在TE溶液中65℃保温融化， 用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。
➢ 这个方法需要用到酚氯仿等有机试剂，由于乙醇沉 淀需时较长，现已较少使用。
11
2.1.4 透析带电洗脱法
➢ 切下的条带放在充满TAE的透析带中电泳，让 DNA跑出 凝胶，跑向溶液中，再通过反向电泳，将附在透析带上 的DNA赶回溶液中，取溶液部分，再用TAE洗洗袋子， 合并溶液后传统方法酚抽沉淀。再次电泳后的胶通常还 要再染色看看残留。
➢ 最简单快速的回收方法。 ➢ 不适合用于大片断的回收。
8
大家学习辛苦了，还是要坚持
继续保持安静
2.1.2 玻璃奶/纯化填料法
玻璃奶/纯化 填料法
➢ 利用特殊玻璃微珠吸附DNA 的特性，根据每次回收实验 时预期回收量来调整纯化填 料的量，使得实验不受限于 柱子的载量，也不会造成浪 费。
➢ 适合各种不同大小的片断， 特别是大片断的回收。
切割 回收
Lane M:1kb DNA Marker Lane 1:胶回收前的2.7kb DNA段 Lane 2:胶回收后的2.7kb DNA段 切割Lane 1后，经处理回收DNA，经 电泳得到Lane 2。
4
1.2 胶回收原理
➢ 利用核酸在裂解 液下与硅胶膜吸 附柱特异性结合， 在洗脱液条件下 被洗脱，从而达 到核酸纯化回收 的目的。
至胶块完全溶解。
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4.1 实验流程
4.1.4 吸附DNA
1
2
将所得溶液加入 一个吸附柱CA2中，
室温放置2min
12000rpm, 离心30~60sec
3
弃废液，将吸附柱 重新放回收集管中
注：吸附柱容积为800μL，若样品体积大于800μL可分批加入。
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4.1 实验流程
4.1.5 洗去杂质
1
向吸附膜中间 位置悬空滴加适量 洗脱缓冲液EB，
室温放置2min
3
12000rpm, 离心2min 收集DNA溶液
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4.1 实验流程
4.1.8 结果分析- 琼脂糖凝胶电泳
原理：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动称为电泳。 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。
５除杂质
1
向吸附柱CA2中 加入μL漂洗液PW
2
12000rpm, 离心30~60sec
3
弃废液，将吸 附柱重新放回收 集管中。重复操作
1,2,3
６去漂洗液
1
将吸附柱CA2 放回收集管中
2
12000rpm, 离心2min
3
将吸附柱CA2 置于室温放置数
分钟，晾干
胶回收标准实验流程－实验流程
７收集ＤＮＡ
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4.2 注意事项
2.平衡液BL的加入能够改善吸附柱的吸 附能力并提高吸附柱的均一性和稳定性， 消除高温/潮湿或其他不良环境因素对吸 附柱造成的影响。使用前请先检查平衡 液BL是否出现浑浊，如有浑浊现象，可 在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄 清。
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4.2 注意事项
3.电泳时最好使用新的电泳缓冲液，以免影响电 泳和回收效果。 4.如下一步实验要求较高，则应尽量使用TAE电泳 缓冲液。 ５.如果回收率较低，可在胶充分溶解后检测pH值， 如pH值大于7.5，可向含有DNA的胶溶液中加 10~30μL3M醋酸钠（pH5.2)将pH值调制5~7之 间。
3
弃废液，将吸附柱 重新放回收集管中
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4.1 实验流目的条带从 琼脂糖凝胶中
切下
2
放入干净的 离心管中
3
称取重量
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4.1 实验流程
4.1.3 溶胶
1
向胶块中加入 等体积溶液PN
2
50℃水浴，不 断温和地上下翻 转离心管，确保 胶块充分溶胶。
注：1.如果凝胶重0.1g，其体积可视为100μL，则加入100μL溶液PN。 2.若胶块未完全溶胶，可继续放置几分钟或补加一些溶胶液，直
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4.2 注意事项
６.切胶是，紫外照射时间应尽量短，以免对 DNA造成损伤。 7.回收<100bp及>10kb的DNA片段时，应加 大溶胶液的体积，延长吸附和洗脱的时间。 8.回收率与初始DNA量和洗脱体积有关，初始 量越少、洗脱体积越少，回收率越低。
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目录
一 胶回收基础知识 二 方法及应用 三 试剂耗材与设备 四 操作流程 五 常见问题解答
收集管中
3
称取重量
胶回收标准实验流程－实验流程
３溶胶
1
向胶块中加入 等体积溶液PN
2
50℃水浴，不 断温和地上下翻 转离心管，确保 胶块充分溶胶。
４吸附
1
将所得溶液加 入 一个吸附柱 CA2中，室温放
置2min
2
12000rpm, 离心30~60sec
3
弃废液，将吸 附柱重新放回收
集管中
胶回收标准实验流程－实验流程
② 放入微波炉中加热，约煮沸三次，冷 却至不烫手；
③ 加入2.5μLNuclleic Acid Stain核酸 染料，轻轻摇匀，避免产生气泡，倒 入已垂直插好梳子的铺胶版中，待凝 固。
① 取 1μL 上 样 缓 冲 液 与 5μL 产 物混匀
② 垂直加入上样 孔中。
电泳条件： 140V， 20min。