微生物限度方法学验证

微生物限度检查
方法学验证
一、检验方法
依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。

表4试剂
稀释液：
（1）pH6.8
取，摇匀，既得。

（2）0.9%
（3）0.05
用。

（4
20ml徐徐滴入。

1细菌、霉菌、酵母菌
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。

上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌
氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。

2控制菌
接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。

用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。

菌悬液在室温
下放置应在
1
2
2.1
30～35℃培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉1ml(内含菌约50～100cfu)，注入无菌平皿中（取用黑曲霉时应注意自身安全），立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数。

同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验，作为对照。

其大小、形态应与对照培养基一致，且数量应不小于对照培养基的70%。

细菌、霉菌及酵母菌培养基适用性检查
证明此批次培养基可以准确的检测出相应微生物情况。

2.2控制菌
2.2.1促生长能力
取大肠埃希菌菌悬液0.1ml（内含菌约10～100cfu），分别置于胆盐乳糖培养基、MUG培养基、营养肉汤培养基中；取乙型副伤寒沙门菌0.1ml（内含菌约10～100cfu），分别接种于营养肉汤培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基，取乙型副伤寒沙门菌0.1ml（内含菌约10～100cfu）涂布于胆盐硫
乳琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基中；于35℃培养18小时，同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验，作为对照，每个培养基平行制备2个平皿。

胆盐乳糖培养基、营养肉汤培养基、MUG培养基与对照管比较，被检培养基管试验菌应生长良好；胆盐硫乳琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。

2.2.2抑制能力
取金黄色葡萄球菌100cfu左右，注入无菌平皿中，立即倾注胆盐乳糖培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基，每个培养基平行制备2个平皿，混匀，凝固，置35℃培养18小时，应不得有菌生长。

3.1.4供试品对照组：取供试液1ml，分别注入15～20ml温度不超过45℃溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基培养，每个培养基平行制备2个平皿。

3.1.5回收率标准
)、以菌液组为对照(T)、以试验组为测试品(C)计：
以供试品对照组为样品空白(C
)/T≥70%
(C-C
细菌、霉菌及酵母菌抑菌性检测结果统计
不具备抑菌性。

3.2控制菌
3.2.1大肠埃希菌
取10ml供试液（制备方法同3.1.1）及大肠埃希菌菌悬液1ml(10～100cfu)加入胆盐乳糖培养基100ml，于35℃培养24小时。

取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，
培养，于5小时、24小时在366nm紫外灯下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。

观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液。

紫外灯照射时管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性；加入靛基质试液时液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。

3.2.2沙门氏菌
取10ml供试液（制备方法同3.1.1）及乙型副伤寒沙门菌1ml(10～100cfu)，直接接种至
不对检测结果造成假阴性的影响。

五、本品微生物限度检查方法的确定
综上所述，本品细菌、霉菌及酵母菌检查采用常规平皿法，取1：10稀释级供试液1ml置90mm 的无菌平面皿中，注入15～20ml培养基进行培养；大肠埃希菌按常规法检验。

1ml供试品中，细菌数不得过1000cfu，霉菌和酵母菌数不得过100cfu，大肠埃希菌不得检出；每10ml不得检出沙门菌。

六、样品微生物限度检查结果
取3批样品，按验证过的方法进行微生物限度检查，结果如下。

微生物限度检查结果
仅供个人学习参考。