鲜地黄药材、鲜地黄中药配方颗粒的检测方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011016201.2
(22)申请日 2020.09.24
(71)申请人 广东一方制药有限公司
地址 528244 广东省佛山市南海区里水镇
旗峰工业开发区
(72)发明人 徐杰　张志鹏　张正　黄梦婷　
黄瑶　陈丹燕　潘玲　彭帮贵　
孙冬梅　刘燎原　魏梅　程学仁　
(74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理
有限公司 44224
代理人 向薇
(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)
G01N 30/06(2006.01)
G01N 30/86(2006.01)
G01N 30/74(2006.01)
(54)发明名称鲜地黄药材、鲜地黄中药配方颗粒的检测方法(57)摘要本发明涉及一种鲜地黄药材、鲜地黄中药配方颗粒的检测方法，包括如下步骤：待测样品溶液制备：取待测鲜地黄药材或鲜地黄中药配方颗粒，加入提取溶剂进行提取，取提取液，制备所述待测样品溶液；检测：以超高效液相色谱对所述待测样品溶液进行检测，并将检测所得图谱与构建获得的鲜地黄标准汤剂特征图谱进行对比。

所述检测方法，可以全面的反映鲜地黄药材、中药配方颗粒的主要化学成分信息，便于对鲜地黄药材、中药配方颗粒的质量进行全面监控。

且该检测方法操作简便、耗时较短、精密度高、准确度高、稳定性好、重现性好，
便于大规模推广应用。

权利要求书2页 说明书13页 附图5页CN 112255330 A 2021.01.22
C N 112255330
A
1.一种鲜地黄标准汤剂特征图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
对照品溶液和供试品溶液制备：取梓醇、地黄苷D和益母草苷对照品，加溶剂溶解，制备所述对照品溶液；取鲜地黄标准汤剂的冻干粉，加入提取溶剂进行提取，取提取液，制备所述供试品溶液；
检测：以超高效液相色谱对所述对照品溶液和供试品溶液进行检测；所述超高效液相色谱采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.05～0.15％的磷酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱包括如下程序：
0～5min，保持所述流动相A的体积百分比为0％；
5～7min，所述流动相A的体积百分比由0％上升至5％；
7～10min，保持所述流动相A的体积百分比为5％；
10～16min，所述流动相A的体积百分比由5％上升至11％；
16～18min，所述流动相A的体积百分比由11％上升至16％；
18～35min，所述流动相A的体积百分比由16％上升至30％。

2.根据权利要求1所述的鲜地黄标准汤剂特征图谱的构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱还包括如下检测条件：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速：0.25～0.35mL/min；柱温：25～35℃。

3.根据权利要求1所述的鲜地黄标准汤剂特征图谱的构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱采用的检测波长为200～400nm。

4.根据权利要求1～3任一项所述的鲜地黄标准汤剂特征图谱的构建方法，其特征在于，所述提取溶剂为体积分数为60％～80％的甲醇水溶液。

5.根据权利要求4所述的鲜地黄标准汤剂特征图谱的构建方法，其特征在于，所述提取的方法为超声提取；所述超声提取采用的超声功率为200～300W、频率为30～50kHZ；所述提取的时间为30～60min。

6.根据权利要求1～3任一项所述的鲜地黄标准汤剂特征图谱的构建方法，其特征在于，所述特征图谱包含10个共有峰，所述共有峰中包括梓醇、地黄苷D和益母草苷的特征峰；所述超高效液相色谱的检测时间为35min以内。

7.一种鲜地黄药材、鲜地黄中药配方颗粒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
待测样品溶液制备：取待测鲜地黄药材或鲜地黄中药配方颗粒，加入提取溶剂进行提取，取提取液，制备所述待测样品溶液；
检测：以超高效液相色谱对所述待测样品溶液进行检测，并将检测所得图谱与权利要求1～6任一项所述构建方法构建获得的鲜地黄标准汤剂特征图谱进行对比；
所述超高效液相色谱采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.05～0.15％的磷酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱包括如下程序：
0～5min，保持所述流动相A的体积百分比为0％；
5～7min，所述流动相A的体积百分比由0％上升至5％；
7～10min，保持所述流动相A的体积百分比为5％；
10～16min，所述流动相A的体积百分比由5％上升至11％；
16～18min，所述流动相A的体积百分比由11％上升至16％；
18～35min，所述流动相A的体积百分比由16％上升至30％。

8.根据权利要求7所述的鲜地黄药材、鲜地黄中药配方颗粒的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱还包括如下检测条件：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速：0.25～0.35mL/min；柱温：25～35℃。

9.根据权利要求7所述的鲜地黄药材、鲜地黄中药配方颗粒的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱采用的检测波长为200～400nm。

10.根据权利要求7～9任一项所述的鲜地黄药材、鲜地黄中药配方颗粒的检测方法，其特征在于，所述提取溶剂为体积分数为60％～80％的甲醇水溶液。

11.根据权利要求10所述的鲜地黄药材、鲜地黄中药配方颗粒的检测方法，其特征在于，所述提取的方法为超声提取；所述超声提取采用的超声功率为200～300W、频率为30～50kHZ；所述提取的时间为30～60min。

12.根据权利要求7～9任一项所述的鲜地黄药材、鲜地黄中药配方颗粒的检测方法，其特征在于，所述鲜地黄中药配方颗粒的制备方法包括如下步骤：取鲜地黄饮片，以水为溶媒进行榨汁或提取，所得提取液进行浓缩、干燥以及制粒。

鲜地黄药材、鲜地黄中药配方颗粒的检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及中药检测技术领域，特别是一种鲜地黄标准汤剂特征图谱的构建方法，以及鲜地黄药材、鲜地黄中药配方颗粒的检测方法。

背景技术
[0002]鲜地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜块根，味甘、苦，性寒，具有清热生津、凉血、止血的功效，用于热病伤阴、舌绛烦渴、温毒发斑、吐血、衄血、咽喉肿痛等，是中医传统常用的鲜药材。

[0003]由于储藏运输困难、供货渠道单一、临床使用不便等因素的限制，传统验方中的鲜地黄多被生地黄取代。

但研究表明，鲜地黄的主要药效成分为环烯醚萜苷类化合物，其在炮制加工的过程中极易降解，且鲜地黄的止血、免疫作用显著强于生地黄，若临床上均以干品替代鲜品组方使用，不仅不能发挥鲜地黄特殊的药效作用，也与中医传统用药理论相悖。

[0004]中药配方颗粒具有不需煎煮、直接冲服、服用量少、卫生安全、携带保存方便等优点。

将鲜地黄药材制备成配方颗粒，则可以解决其保鲜、储藏、运输、临床调剂等诸多问题，同时可以发挥其鲜药鲜用的特性。

标准汤剂可用以标化鲜地黄配方颗粒的质量，确保其临床用药的准确性、剂量及疗效的一致性。

[0005]传统鲜地黄相关的特征图谱构建方法是针对鲜地黄经榨汁和甲醇提取获得的供试品，该构建方法的检测时长长达90min，分析耗时长、试剂用量大、检测成本高，不利于推广应用，且受限于其供试品的制备方法，其在鲜地黄制剂检测上应用的适应性也尚需确认。

[0006]因此，现有冻干饮片粉、榨汁喷干粉以及中药配方颗粒等多种鲜地黄现代制剂，但鲜地黄标准汤剂的UPLC特征图谱检测方法尚未见报导。

中药特征图谱是对中药整体性化学特征的表达和反映，特征图谱的一致性也是中药配方颗粒与标准汤剂一致性的重要表征。

因此，建立鲜地黄标准汤剂的特征图谱，以用于鲜地黄药材及其制剂的质量检测是非常必要的。

发明内容
[0007]基于此，有必要提供一种鲜地黄标准汤剂特征图谱的构建方法。

该构建方法能够构建得到鲜地黄标准汤剂特征图谱，能够较全面的反映鲜地黄标准汤剂环烯醚萜苷类化学成分的信息，且耗时较短。

[0008]一种鲜地黄标准汤剂特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
[0009]对照品溶液和供试品溶液制备：取梓醇、地黄苷D和益母草苷对照品，加溶剂溶解，制备所述对照品溶液；取鲜地黄标准汤剂的冻干粉，加入提取溶剂进行提取，取提取液，制备所述供试品溶液；
[0010]检测：以超高效液相色谱对所述对照品溶液和供试品溶液进行检测；所述超高效液相色谱采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.05～0.15％的磷酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱包括如下程序：
[0012]5～7min，所述流动相A的体积百分比由0％上升至5％；
[0013]7～10min，保持所述流动相A的体积百分比为5％；
[0014]10～16min，所述流动相A的体积百分比由5％上升至11％；
[0015]16～18min，所述流动相A的体积百分比由11％上升至16％；
[0016]18～35min，所述流动相A的体积百分比由16％上升至30％。

[0017]在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱还包括如下检测条件：
[0018]色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速：0.25～0.35mL/min；柱温：25～35℃。

优选地，所述流速为0.28～0.32mL/min；所述柱温为28～32℃。

[0019]在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱采用的检测波长为200～400nm。

优选地，所述检测波长为200～210nm。

更为优选地，所述检测波长为200～205nm。

[0020]在其中一个实施例中，所述提取溶剂为体积分数为60％～80％的甲醇水溶液。

优先地，所述提取溶剂为体积分数为60％～65％的甲醇水溶液。

[0021]在其中一个实施例中，所述提取溶剂的用量为每g所述鲜地黄标准汤剂的冻干粉加入125～375mL。

[0022]在其中一个实施例中，所述提取的方法为超声提取；所述超声提取采用的超声功率为200～300W、频率为30～50kHZ；所述提取的时间为30～60min。

优选地，所述提取的时间为55～60min。

[0023]在其中一个实施例中，所述流动相B为体积分数为0.08～0.12％的磷酸水溶液。

[0024]在其中一个实施例中，制备所述供试品溶液还包括：将所述提取液过滤，取续滤液浓缩，再加入所述流动相B稀释，再次过滤，取续滤液。

[0025]在其中一个实施例中，制备所述对照品溶液中，所述溶剂为所述流动相B。

[0026]在其中一个实施例中，所述特征图谱包含10个共有峰，所述共有峰中包括梓醇、地黄苷D和益母草苷的特征峰；所述超高效液相色谱的检测时间为35min以内。

[0027]可以理解地，如上所述的鲜地黄标准汤剂的冻干粉可采用本领域的传统方法制备，具体可以包括如下步骤：取鲜地黄饮片，加水提取，过滤，所得提取液浓缩并冷冻干燥。

更为具体地，所述加水提取的方法为加水两次煎煮提取：
[0028]一煎加入所述鲜地黄饮片重量7～11倍量的水，武火加热至沸腾后，文火煎煮20～60min；二煎加入所述鲜地黄饮片重量5～9倍量水，武火加热至沸腾后，文火煎煮15～45min。

[0029]本发明还提供一种鲜地黄药材、鲜地黄中药配方颗粒的检测方法，包括如下步骤：[0030]待测样品溶液制备：取待测鲜地黄药材或鲜地黄中药配方颗粒，加入提取溶剂进行提取，取提取液，制备所述待测样品溶液；
[0031]检测：以超高效液相色谱对所述待测样品溶液进行检测，并将检测所得图谱与如上所述构建方法构建获得的鲜地黄标准汤剂特征图谱进行对比；
[0032]所述超高效液相色谱采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.05～0.15％的磷酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱包括如下程序：
[0033]0～5min，保持所述流动相A的体积百分比为0％；
[0034]5～7min，所述流动相A的体积百分比由0％上升至5％；
[0036]10～16min，所述流动相A的体积百分比由5％上升至11％；
[0037]16～18min，所述流动相A的体积百分比由11％上升至16％；
[0038]18～35min，所述流动相A的体积百分比由16％上升至30％。

[0039]在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱还包括如下检测条件：
[0040]色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速：0.25～0.35mL/min；柱温：25～35℃。

优选地，所述流速为0.28～0.32mL/min；所述柱温为28～32℃。

[0041]在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱采用的检测波长为200～400nm。

优选地，所述检测波长为200～210nm。

更为优选地，所述检测波长为200～205nm。

[0042]在其中一个实施例中，所述提取溶剂为体积分数为60％～80％的甲醇水溶液。

优先地，所述提取溶剂为体积分数为60％～65％的甲醇水溶液。

[0043]在其中一个实施例中，所述提取的方法为超声提取；所述超声提取采用的超声功率为200～300W、频率为30～50kHZ；所述提取的时间为30～60min。

优选地，所述提取的时间为55～60min。

[0044]在其中一个实施例中，所述流动相B为体积分数为0.08～0.12％的磷酸水溶液。

[0045]在其中一个实施例中，制备所述待测样品溶液还包括：将所述提取液过滤，取续滤液浓缩，再加入所述流动相B稀释，再次过滤，取续滤液。

[0046]在其中一个实施例中，所述鲜地黄中药配方颗粒的制备方法包括如下步骤：取鲜地黄饮片，以水为溶媒进行榨汁或提取，所得提取液进行浓缩、干燥以及制粒。

[0047]与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
[0048]本发明的鲜地黄标准汤剂特征图谱的构建方法可以构建获得检测鲜地黄标准汤剂的特征图谱，能够全面地反映鲜地黄标准汤剂的主要化学成分信息，且用时较现有技术明显缩短，有利于鲜地黄药材以及制剂(如中药配方颗粒)的质量控制及评价评估，使其主要指标成分与传统汤剂保持一致，为鲜地黄制剂的质量研究及标准建立提供了参考。

[0049]本发明的鲜地黄药材、鲜地黄中药配方颗粒的检测方法，可以全面的反映鲜地黄药材、中药配方颗粒的主要化学成分信息，便于对鲜地黄药材、中药配方颗粒的质量进行全面监控。

且该检测方法操作简便、耗时较短、精密度高、准确度高、稳定性好、重现性好，便于大规模推广应用。

附图说明
[0050]图1为本发明一实施例中的鲜地黄标准汤剂冻干粉的特征图谱(峰3：梓醇；峰4：地黄苷D(S)；峰6：益母草苷)；
[0051]图2为上述特征图谱建立过程中全波长扫描3D色谱图；
[0052]图3为上述特征图谱建立过程中吸收波长考察的色谱图；
[0053]图4为上述特征图谱建立过程中柱温考察的色谱图；
[0054]图5为上述特征图谱建立过程中流速考察的色谱图；
[0055]图6为上述特征图谱建立过程中整体性考察的色谱图；
[0056]图7为上述特征图谱建立过程中鲜地黄标准汤剂冻干粉的特征峰指认色谱图；[0057]图8为32批鲜地黄标准汤剂冻干粉的特征图谱；
[0058]图9为32批鲜地黄药材的特征图谱；
[0059]图10为3批鲜地黄配方颗粒的质量检测色谱图。

具体实施方式
[0060]以下结合具体实施例对本发明的鲜地黄药材、鲜地黄中药配方颗粒的检测方法作进一步详细的说明。

本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。

相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。

[0061]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

[0062]本发明的实施例中采用的仪器和试药如下：
[0063]1、仪器
[0064]超高效液相色谱仪：Waters H-Class UPLC；
[0065]电子天平：ME203E、ME204E、XP26(METTLER TOLEDO公司)；
[0066]超纯水机：MiliQ Direct 8(默克密理博公司)；
[0067]色谱柱：Waters ACQUITY HSS T3(2.1mm×100mm，1.8μm)。

[0068]2、试药
[0069]乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

[0070]梓醇(批号：110808-201711，含量以99.6％计，中国食品药品检定研究院)；地黄苷D(批号：ST11190120，含量以98％计，上海诗丹德标准技术服务有限公司)；益母草苷(批号：17122601，含量以99.62％计，成都普菲德生物技术有限公司)。

[0071]鲜地黄标准汤剂的冻干粉：批号BT1、BT2、BT3、BT4、BT5、BT6、BT7、BT8、BT9、BT10、BT11、BT12、BT13、BT14、BT15、BT16、BT17、BT18、BT19、BT20、BT21、BT22、BT23、BT24、BT25、BT26、BT27、BT28、BT29、BT30、BT31、BT32。

[0072]鲜地黄药材：批号YC1、YC2、YC3、YC4、YC5、YC6、YC7、YC8、YC9、YC10、YC11、YC12、YC13、YC14、YC15、YC16、YC17、YC18、YC19、YC20、YC21、YC22、YC23、YC24、YC25、YC26、YC27、YC28、YC29、YC30、YC31、YC32。

[0073]鲜地黄中药配方颗粒：批号KL1、KL2、KL3，由均是以鲜地黄饮片为原料，以水为溶媒进行提取、浓缩、干燥、加辅料制成的鲜地黄中药配方颗粒剂。

[0074]如无特别说明，本发明实施例中的百分比均为体积百分比，所述武火是指180～200℃，文火是指120～150℃。

本发明实施例中的“超声”是指在超声功率为250W、频率为40kHZ条件下进行超声。

[0075]实施例1鲜地黄标准汤剂的特征图谱的建立方法
[0076]所述建立方法的步骤如下：
[0077]1)鲜地黄标准汤剂的冻干粉的制备：取鲜地黄药材，去除芦头、须根和泥沙，切厚片，得鲜地黄饮片；称取鲜地黄饮片100g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加入9倍量水，浸泡30分钟，武火煮沸后文火保持微沸30分钟，煎液经350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第二次加入7倍量水，武火加热煮沸后文火保持微沸25分钟，煎液用350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，合并两次煎液；采用旋转蒸发仪减压低温浓缩至投料
量：清膏质量为1:0.5的浸膏；在磁力搅拌下分装至10mL棕色西林瓶中，分装完后转移至真空冷冻干燥机中冻干。

[0078]2)对照品溶液制备：取梓醇、地黄苷D、益母草苷对照品适量，精密称定，分别加0.1％磷酸水溶液制成每1mL含100μg各对照品的对照品溶液，即得。

[0079]3)供试品溶液制备：取鲜地黄标准汤剂的冻干粉末0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇水溶液25mL，密塞，称定重量，超声30分钟，放冷，再称定重量，用60％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，浓缩至近干，残渣用0.1％磷酸溶解，转移至10mL量瓶中，加0.1％磷酸至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

[0080]4)检测：分别吸取对照品溶液、供试品溶液各2μL，注入超高效液相色谱仪，色谱条件如下：
[0081]以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters ACQUITY HSS T3，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水溶液为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL；柱温为30℃；检测波长203nm。

理论板数按地黄苷D峰计算应不低于8000。

[0082]表1
[0083]
[0084]鲜地黄标准汤剂特征图谱确立：特征图谱如图1所示，色谱中应呈现10个特征峰，与地黄苷D参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的±10％之内，规定值为：0.27(峰1)、0.31(峰2)、0.58(峰3)、1.03(峰5)、1.15(峰6)、1.34(峰7)、1.80(峰8)、1.91(峰9)、2.03(峰10)。

[0085]一、色谱条件与系统适应性试验
[0086]最佳吸收波长的考察：利用PDA检测器对供试品溶液进行全波长扫描，并分别在203nm、210nm下采集供试品溶液的色谱图，对采集的色谱图进行比较，确定最佳波长，结果如图2、图3所示。

结果表明，鲜地黄标准汤剂特征图谱主要色谱峰在波长200nm左右有较强吸收；相较于210nm，波长在203nm下各色谱峰峰型好，且主要色谱峰吸收强度高，因此选择波长为203nm。

[0087]柱温考察：在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为25℃、30℃、35℃时进行考察，结果如图4所示。

结果表明，在柱温为30℃时，色谱图峰形较好，分离度适中。

故柱温确定为30℃。

[0088]流速考察：在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.25mL/min、0.3mL/min、0.35mL/min时进行考察，结果如图5所示。

结果表明，在流速为0.3mL/min时，色谱图峰形较好，分离度适中。

故流速确定为0.3mL/min。

[0089]整体性考察：在以上拟定的实验条件基础上，将色谱峰采集时间延长至70min，结
果如图6所示。

结果表明，35分钟后，仍以30％乙腈等度洗脱至70分钟，发现35分钟之后已无色谱峰出现。

故色谱图采集35分钟时，色谱信息已采集完全。

将色谱图采集时间确定为35分钟。

[0090]综上所述，鲜地黄标准汤剂特征图谱的最佳色谱条件与系统适应性试验确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters ACQUITY HSS T3色谱柱，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水溶液为流动相B，按表1的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL；柱温为30℃；检测波长为203nm。

理论板数按地黄苷D峰计算应不低于8000。

[0091]二、供试品溶液的制备考察
[0092]提取溶剂考察：取鲜地黄标准汤剂的冻干粉约0.1g，平行5份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇、80％甲醇、甲醇25mL，称定重量，超声处理30分钟，取出放冷，再称定重量，用各自溶剂补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，浓缩至近干，残渣用0.1％磷酸溶解，转移至10mL量瓶中，加0.1％磷酸至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

结果见表8。

[0093]表8
[0094]
[0095]
[0096]结果表明，60％甲醇水溶液和80％甲醇水溶液提取效果较好，“总峰面积/称样量”值最高；60％甲醇水溶液与80％甲醇水溶液提取效果差异不明显，基于节约溶剂成本考虑，确定提取溶剂为60％甲醇水溶液。

[0097]提取方式考察：取鲜地黄标准汤剂的冻干粉约0.1g，平行2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇25mL，称定重量，分别采用超声处理30min及加热回流30min，放冷，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，精密量取续滤液10mL，浓缩至近干，残渣用0.1％磷酸溶解，转移至10mL量瓶中，加0.1％磷酸至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

结果见表9。

[0098]表9
[0099]
[0100]结果表明，通过对比回流、超声两种提取方式，发现两者在色谱峰数目、色谱峰分离效果方面没有明显差异，但超声提取各色谱峰“总峰面积/称样量”大于回流，且操作简便，故选择超声提取。

[0101]提取溶剂用量考察：取鲜地黄标准汤剂的冻干粉约0.2g，平行3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入60％甲醇25mL、50mL、75mL，密塞，称定质量，超声处理30分钟，取
出，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，精密量取续滤液10mL，浓缩至近干，残渣用0.1％磷酸溶解，转移至10mL量瓶中，加0.1％磷酸至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

结果见表10。

[0102]表10
[0103]
[0104]
[0105]结果表明，提取溶剂用量为25mL、50mL、75mL时，三者特征图谱的差异不大，基于节约溶剂考虑，故确定提取溶剂用量为25mL。

[0106]提取时间考察：取鲜地黄标准汤剂的冻干粉约0.2g，平行3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇25mL，称定重量，分别超声处理30min、45min、60min，放冷，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，精密量取续滤液10mL，浓缩至近干，残渣用0.1％磷酸溶解，转移至10mL量瓶中，加0.1％磷酸至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

结果见表11。

[0107]表11
[0108]
[0109]结果表明，提取时间为60分钟时，提取效果最好，“总峰面积/称样量”值最大，为保证鲜地黄标准汤剂的冻干粉各特征成分的充分提取，故提取时间确定为60分钟。

[0110]综上所述，取本品适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声提取60min，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足失重，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，浓缩至近干，残渣用0.1％磷酸溶解，转移至10mL量瓶中，加0.1％磷酸至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

[0111]三、色谱峰指认
[0112]供试品溶液的制备：按如上拟定实验方法制备鲜地黄标准汤剂冻干粉的供试品溶液。

[0113]阴性对照品溶液的制备：按如上拟定实验方法制备缺鲜地黄标准汤剂冻干粉的阴性对照溶液。

[0114]对照品溶液的制备：取梓醇、地黄苷D、益母草苷对照品适量，加0.1％磷酸水溶液配制成每1mL含100μg的各对照品的对照品溶液。

对鲜地黄标准汤剂的特征图谱峰进行定位，具体如图7所示。

[0115]四、方法学验证
[0116]精密度试验：取鲜地黄标准汤剂的冻干粉末约0.2g，精密称定，按如上拟定实验方法进行供试品溶液的制备及测定，连续进样6次，结果见表12、13。

[0117]精密度考察结果显示：连续进样6针，各共有峰的相对保留时间RSD在0.00％～
0.90％范围内，相对峰面积的RSD在0.00％～3.05％范围内，RSD均小于4％，表明仪器精密度较好。

[0118]表12
[0119]
[0120]表13
[0121]
[0122]
[0123]重复性试验：精密称取鲜地黄标准汤剂的冻干粉6份，按如上拟定实验方法进行供试品溶液的制备及测定，结果见表14、15。

[0124]表14。