生化与分子生物学技术原理
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生化与分子生物学 技术原理
曹凯鸣 复旦大学生命科学学院 2006年11月
第一章
核酸的基本结构和性质
一.基本的化学组成 经不同程度水解可获得核酸各种组成部分 核苷酸 nucleotide Nt 核苷 nucleoside Ns 碱基 嘌呤 purine Pu 嘧啶 pyrimidine Py 碱基三字符号 Ade Cyt Gua Thy Ura Ns单字符号 (d) A C G T U Ns, Nt, oligoNts 中均为D-戊糖
(B-form double DNA)
(A-form double DNA)
三. 核苷的顺反构象( syn-anti 构象)
核糖和碱基以N-糖苷键连接成核苷， 核苷中碱基平面绕糖苷键旋转形成核苷的 顺反构象。 扭转角决定核苷的构象 • 存在 溶液: 顺反式可互换 结晶: 顺反式不可互换
C3’-endo
6.甲基化与基因表达 a. 原核生物DNA甲基化 • 限制修饰系统 • DNA甲基化与复制 E. coli dam G *ATC dcm C *CA/TGG
完全甲基化 oriC 复制活性 半甲基化 oriC 抑制复制活性 oriC, dna 甲基化速度与复制循环 半甲基化 oriC 与膜结合抑制复制(抑制剂)
W
异丙烯 Gua
Q
7-去N-Gua
tRNA anticodon 3’邻位
tRNA anticodon 摆动位
2.修饰核糖
RNA C2’-OH 甲基化 ( Nm )
抗水解 (Rnase ,[ OH¯ ]) 二聚体 NmpNp 3. 糖苷键不同 假尿苷 ψ (tRNA rRNA) C5-C1’ 糖苷键 4. 修饰符号 1A 7G Cm Ψm m 2 G m2.2.7G m m 2 3
• N-糖苷键 碱稳定 酸不稳定 DNA > RNA dNs > Ns 嘌呤Ns > / 2’ or 3’-Nt
Pu, Py, 多聚核糖-P碎片 磷酸二酯键 ￬ 嘧啶糖苷键 ￬ 嘌呤糖苷键 Pu, PyNt, 碎片 嘧啶糖苷键 ￬ 磷酸二酯键 ￬ 嘌呤糖苷键
• 强(Hard) 烷化剂
N-甲基-N-亚硝基脲(MNU) N-乙基-N-亚硝基脲(ENU) Me N , O 核酸 50% 磷酸酯烷化 烷化剂直接致癌 DMS G-O6 : G-N7 = 0.004 : 1 MNU G-O6 : G-N7 = 0.08 : 1 ( 肝 ) G-O6 : G-N7 = 0.15 : 1 ( 脑 ) G-N7(Me)不改变G:C配对 G-O6(Me)不影响 DNA pol,但改变碱基对, G T
3. 碱基上反应 a. 烷基化反应(-CH3 ) 碱基上除 Pu N-9 , Py N-1外,所有N和O原子 均可因亲电攻击而甲基化。
• 温和( Soft ) 烷化剂 硫酸二甲酯 甲基硫烷 烷基化物 DMS MMS MeI Me N G-N7 > A-N1 > C-N3 > T-N3 DMS作用于dsDNA A-N3(Me) , 阻止DNA pol.
低速率
转录
• Promoter -CpG- 甲基化与转录 γ -globin gene –200 — +90 有甲基化基团 mCpG 转录受阻 除去部分 mCpG 转录受阻 除去所有 CpG 转录
5-氮胞苷抑制甲基化,瞬时去甲基化 5-NC ￬ 成纤维细胞 肌肉细胞 ( 多核 ,有条纹, 可收缩 )
* dam– 半甲基化产物积累
b.真核生物DNA甲基化 • 甲基化在两条链上, 对称分布 真核生物 5’-mCpG-3’ 植物 5’-mCNG-3’ dC mdC 影响DNA-蛋白质相互作用 • 甲基化格式具有组织专一性 pattern of methylation 格式变化: 配子发生时期, 胚胎发育早 期,病毒感染 格式维持:DNA甲基化酶维持配子和体 细胞甲基化状态
核酸中的核糖有多种构象 核糖的五员环不处于一个平面，C1，，O， 和 C4’ 三个原子在一个平面上，C2’ 或/和 C3’ 偏离此平面，使核糖产生不同的构象。
• 内式构象(endo)偏离平面的方向和 C5’同向 • 外式构象(exo) 偏离平面的方向和 C5’反向
1. 信封式 (Envelope, E ) 糖环的 C 2’或 C 3’ 1个原子偏离平面的折 叠 C2’-endo ( 2E ) C3’-endo ( 3E ) C2’-exo ( E2 ) C3’-exo ( E3 )
抗生素
嘌呤霉素
细胞激动素 第二信使 能源库
辅酶
二. 糖环的折叠形式 构型(configuration)共价化合物中, 各个原子在空间的相对排列关系。 构型的改变涉及到共价键破坏 核酸中核糖仅一种构型 ： β- D型
构象(conformation) 化合物内可以 自由转动的单键上的原子或基团,绕单 键旋转或随单键扭转,产生几种不同的 空间排列形式。 构象的改变并不伴随共价键的破坏
b. 紫外光谱鉴定 • 溶液样品在 220-290nm 波长内扫描, 确定 λmax and λmin , 对照参数(特定pH )。
例: pH 6-7 λmax A 260 G 253 C 271 U 262 T 267 λmin 227 223 250 230 236
•甲基化与小鼠胚胎发育
knock out 甲基转移酶 gene C 胚胎发育早期 甲基化格式变换,其后细胞 内DNA维持特定的甲基化状态 配子发生期,不同性别配子的甲基化格式是 特定的。其区别使父母等位基因在胚胎中表 达不同。 下一代配子保持相同格式 Igf2 gene IGF-Ⅱ胰岛素-like生长 因子依赖于父本表达 Igf2R gene IGF-ⅡR胰岛素-like生长 因子受体依赖于母本表达
甲基化格式的维持
甲基化格式的限制性内切酶分析
C*CGG CCGG
CCGG
•甲基化与基因表达 鸡珠蛋白基因的组织特异性分析(Mspl Hpall) CpG 表达 (红细胞） mCpG 不表达（肾、脑……)
肌动蛋白( actin gene)表达
高速率 转录 肌肉细胞 actin gene (CpG) 成纤维细胞 actin gene (mCpG)
• tRNA 60余种分布在环区 anticodon loop 高度修饰 Q W • SnRNA uRNA 5’-end Cap m3 G
2.2.7
• 稀有碱基的形成
酶催化
-CH3
碱基交换 Q
tRNA鸟嘌呤 糖苷转移酶
G34 (tRNA) Q Q34 (tRNA) Gua
N- 糖苷键打断、重建
b. DNA • ~10 种 甲基化 • 形成 合成时om5dC参入 phage T 2.4.6 合成后甲基化 m5dC m6dA m4dC DNA 甲基化酶 S-腺苷甲硫氨酸（甲基供体）
• 核糖的脱水反应
酸性条件下，核糖或脱氧核糖脱水产物与 试剂反应生成有色物质。可用定糖法比色测定 DNA or RNA 含量。 • 苔黑酚法测RNA 核糖 -3H O 糠醛
2
• 二苯胺法测 DNA 脱氧核糖-2H O ω- 羟基 -γ- 酮基戊醛
2
六. 核酸组分的分离鉴定
1. 分离 a. 电泳分离 Nt and dNt Nt (dNt ) 的解离及pK值 pH3.5 ， Nts 间净电荷 差异最大.
产物
酸
稳 大 定 ￬ 性 小
2. β-消除反应 连接磷酸基团的 β-C 原子上有强的吸电子基团存 在时, 引起 α-C 原子和 O 原子间的键断裂。 OH R– P– O– CH2– CH2– Z (–CHO, >C=O , –HC=N< ) O α β
DNA and RNA 化学法测序 主链断开
基本的化学组成经不同程度水解可获得核酸各种组成部分核苷酸nucleotident核苷nucleosidens碱基嘌呤purinepu嘧啶pyrimidinepy碱基三字符号adecytguathyurans单字符号nsntoligonts中均为d戊糖碱基可异构化异构平衡仅原子位置变化uvnmr分析生理ph条件下5种碱基9999氨基亚胺n糖苷键连接oligo表示法polypolydadt交替排列polydadt随机排列polya2poly抗生素抗生素第二信使第二信使嘌呤霉素嘌呤霉素细胞激动素细胞激动素能源库能源库辅酶辅酶糖环的折叠形式构型configuration共价化合物中各个原子在空间的相对排列关系
碱基可异构化 异构平衡仅 H 原子位置变化 UV,NMR分析 生理 pH 条件下, 5种碱基 99.99% 以 氨基与酮式存在。
酮式
烯醇式
氨基
亚胺
N-糖苷键
C1 与嘧啶 N1 连接 C1 与嘌呤 N9 连接
oligo 表示法 poly U 均聚物 poly (dA-dT) 交替排列 poly (dA· dT) 随机排列 poly A· 2poly U 按1:2结合成复合物 (三链)
侧视图
内式 外式
2. 扭转式 ( Twist, T ) 糖环的 C2’ 和 C3’ 两个原子都偏离糖平面, 而且取方向相反的折叠。 两个原子偏离糖平面的程度可以相等或不等 侧视图 C2’-endo-C3’-exo C2’-exo-C3’-endo
• 存在 溶液 : Nt , Ns C2’-endo ~ C3’-endo DNA : B-DNA C2’-endo A-DNA(RNA) C3’-endo Z-DNA 胞苷(C) C2’-endo ( 反式） 鸟苷(G) C3’-endo（顺式 ）
一条X-染色体的失活
• 甲基化格式的建立、维持和改变 从无到有(de novo)甲基化 双链相对-CpG-mCpG- 确立新格式
甲基化的维持 脱甲基 被动 主动
复制后不再甲基化 甲基转移 碱基切除修复
• CpG-rich islands 基因组中存在异常非甲基化-CpG-顺序簇 高含量 C+G 高频率 CG dimer (10/100bp ) 分布不均, 长1-2 kb，间隔 ~100 kb 非甲基化 –CpG 存在：housekeeping genes tissues specific genes 5’- 启动子——转录区
ADP质子化状态
b. 层析 • 离子交换层析 高效液相层析 ( HPLC ) • 稀有成分纤维素薄板双向层析 灵敏, 快速, 稳定。 20种 3’- Nt, 22种 5’- Nt, 40种 Ns, 14种抗水 解 NmNp dimer. AmGp ~GmAp CmUp ~ UmCp
2. 鉴定 a. 标准品对照(电泳,层析) UV吸收检出 吸收 UV蓝紫色斑点, G蓝色荧光, D无吸收。
C2’-endo
四. 核酸的修饰成分及甲基化 1948年 小牛胸腺DNA分离 m5dC 特点: • 原有成分的衍生物 • 含量少(百分之几~万分之几) • 主要化学键不变
1.修饰碱基 60余种 Ura Ade Gua Cyt Thy 25 17 12 6 2 • 碱基上原子被其他基团取代 m p om …… • AA衍生物 Base-CO-NH-AA • 糖衍生物 Base-CH2OH-糖(6C) • 非嘌呤,嘧啶衍生物 ( tRNA )
CpG密度 1/100bp
腺嘌呤磷酸核糖 转移酶
CpG密度 10/100bp –100 ~ 300
1
2
3 1. 二氢叶酸还原酶基因 2. 次黄嘌呤转磷酸核糖酶基因 3. 核糖体蛋白质基因
CG mCG
DNA甲基化有助于基因关闭
抑制转录的蛋白质
MeCP-1 MeCP-2 *CpG 成簇 *CpG
5. 分布 a. RNA ~70 • mRNA ( hnRNA mRNA ) 5’-Cap: m7G Nm 分子内: m6A m5C • rRNA 原核 m5C 真核 Nm mN Ψ 高度修饰成分( m1ncp3Ψ ) Hela cell 28S rRNA 65Nm ( 70 ) 18S rRNA 40Nm 6mN
五. 核酸及其化学组分的化学反应 1.水解反应 磷酸二酯键, 磷酸单酯键, N-糖苷键 a. 酶水解 b. 酸碱水解 • 磷酸二酯键 • 酸 热强酸 dA,dG 0.1NHCl 30mi （100°C)
rA,rG 1M HCl 60min rC, rU 12M HClO4 60min • 碱 DNA 不作用 RNA 邻接基团参与效应,生成磷酸 基转移中间物,水解。
b. 卤化反应
嘧啶 5 位 卤素分子 嘌呤 8 位 8-BrPu 标记 5-FU 抗癌药
c. 与醛类反应 碱基的环外 –NH2
AMP: N6-NH2
GMP: N2-NH2
甲醛是DNA不可逆变性剂 •鉴定 ssDNA or dsDNA •破坏RNA高级结构，消除结构对电泳迁移 率的影响
d. 核糖上的反应 • 核糖的氧化反应 核糖的2’，3’-顺二醇被高碘酸( HIO4)氧 化成顺二醛，胺催化 β-消除反应，同时碱基 脱落, 生成磷酸，碱基和糖碎片。 5’-Nt 定量测定 RNA 序列测定
曹凯鸣 复旦大学生命科学学院 2006年11月
第一章
核酸的基本结构和性质
一.基本的化学组成 经不同程度水解可获得核酸各种组成部分 核苷酸 nucleotide Nt 核苷 nucleoside Ns 碱基 嘌呤 purine Pu 嘧啶 pyrimidine Py 碱基三字符号 Ade Cyt Gua Thy Ura Ns单字符号 (d) A C G T U Ns, Nt, oligoNts 中均为D-戊糖
(B-form double DNA)
(A-form double DNA)
三. 核苷的顺反构象( syn-anti 构象)
核糖和碱基以N-糖苷键连接成核苷， 核苷中碱基平面绕糖苷键旋转形成核苷的 顺反构象。 扭转角决定核苷的构象 • 存在 溶液: 顺反式可互换 结晶: 顺反式不可互换
C3’-endo
6.甲基化与基因表达 a. 原核生物DNA甲基化 • 限制修饰系统 • DNA甲基化与复制 E. coli dam G *ATC dcm C *CA/TGG
完全甲基化 oriC 复制活性 半甲基化 oriC 抑制复制活性 oriC, dna 甲基化速度与复制循环 半甲基化 oriC 与膜结合抑制复制(抑制剂)
W
异丙烯 Gua
Q
7-去N-Gua
tRNA anticodon 3’邻位
tRNA anticodon 摆动位
2.修饰核糖
RNA C2’-OH 甲基化 ( Nm )
抗水解 (Rnase ,[ OH¯ ]) 二聚体 NmpNp 3. 糖苷键不同 假尿苷 ψ (tRNA rRNA) C5-C1’ 糖苷键 4. 修饰符号 1A 7G Cm Ψm m 2 G m2.2.7G m m 2 3
• N-糖苷键 碱稳定 酸不稳定 DNA > RNA dNs > Ns 嘌呤Ns > / 2’ or 3’-Nt
Pu, Py, 多聚核糖-P碎片 磷酸二酯键 ￬ 嘧啶糖苷键 ￬ 嘌呤糖苷键 Pu, PyNt, 碎片 嘧啶糖苷键 ￬ 磷酸二酯键 ￬ 嘌呤糖苷键
• 强(Hard) 烷化剂
N-甲基-N-亚硝基脲(MNU) N-乙基-N-亚硝基脲(ENU) Me N , O 核酸 50% 磷酸酯烷化 烷化剂直接致癌 DMS G-O6 : G-N7 = 0.004 : 1 MNU G-O6 : G-N7 = 0.08 : 1 ( 肝 ) G-O6 : G-N7 = 0.15 : 1 ( 脑 ) G-N7(Me)不改变G:C配对 G-O6(Me)不影响 DNA pol,但改变碱基对, G T
3. 碱基上反应 a. 烷基化反应(-CH3 ) 碱基上除 Pu N-9 , Py N-1外,所有N和O原子 均可因亲电攻击而甲基化。
• 温和( Soft ) 烷化剂 硫酸二甲酯 甲基硫烷 烷基化物 DMS MMS MeI Me N G-N7 > A-N1 > C-N3 > T-N3 DMS作用于dsDNA A-N3(Me) , 阻止DNA pol.
低速率
转录
• Promoter -CpG- 甲基化与转录 γ -globin gene –200 — +90 有甲基化基团 mCpG 转录受阻 除去部分 mCpG 转录受阻 除去所有 CpG 转录
5-氮胞苷抑制甲基化,瞬时去甲基化 5-NC ￬ 成纤维细胞 肌肉细胞 ( 多核 ,有条纹, 可收缩 )
* dam– 半甲基化产物积累
b.真核生物DNA甲基化 • 甲基化在两条链上, 对称分布 真核生物 5’-mCpG-3’ 植物 5’-mCNG-3’ dC mdC 影响DNA-蛋白质相互作用 • 甲基化格式具有组织专一性 pattern of methylation 格式变化: 配子发生时期, 胚胎发育早 期,病毒感染 格式维持:DNA甲基化酶维持配子和体 细胞甲基化状态
核酸中的核糖有多种构象 核糖的五员环不处于一个平面，C1，，O， 和 C4’ 三个原子在一个平面上，C2’ 或/和 C3’ 偏离此平面，使核糖产生不同的构象。
• 内式构象(endo)偏离平面的方向和 C5’同向 • 外式构象(exo) 偏离平面的方向和 C5’反向
1. 信封式 (Envelope, E ) 糖环的 C 2’或 C 3’ 1个原子偏离平面的折 叠 C2’-endo ( 2E ) C3’-endo ( 3E ) C2’-exo ( E2 ) C3’-exo ( E3 )
抗生素
嘌呤霉素
细胞激动素 第二信使 能源库
辅酶
二. 糖环的折叠形式 构型(configuration)共价化合物中, 各个原子在空间的相对排列关系。 构型的改变涉及到共价键破坏 核酸中核糖仅一种构型 ： β- D型
构象(conformation) 化合物内可以 自由转动的单键上的原子或基团,绕单 键旋转或随单键扭转,产生几种不同的 空间排列形式。 构象的改变并不伴随共价键的破坏
b. 紫外光谱鉴定 • 溶液样品在 220-290nm 波长内扫描, 确定 λmax and λmin , 对照参数(特定pH )。
例: pH 6-7 λmax A 260 G 253 C 271 U 262 T 267 λmin 227 223 250 230 236
•甲基化与小鼠胚胎发育
knock out 甲基转移酶 gene C 胚胎发育早期 甲基化格式变换,其后细胞 内DNA维持特定的甲基化状态 配子发生期,不同性别配子的甲基化格式是 特定的。其区别使父母等位基因在胚胎中表 达不同。 下一代配子保持相同格式 Igf2 gene IGF-Ⅱ胰岛素-like生长 因子依赖于父本表达 Igf2R gene IGF-ⅡR胰岛素-like生长 因子受体依赖于母本表达
甲基化格式的维持
甲基化格式的限制性内切酶分析
C*CGG CCGG
CCGG
•甲基化与基因表达 鸡珠蛋白基因的组织特异性分析(Mspl Hpall) CpG 表达 (红细胞） mCpG 不表达（肾、脑……)
肌动蛋白( actin gene)表达
高速率 转录 肌肉细胞 actin gene (CpG) 成纤维细胞 actin gene (mCpG)
• tRNA 60余种分布在环区 anticodon loop 高度修饰 Q W • SnRNA uRNA 5’-end Cap m3 G
2.2.7
• 稀有碱基的形成
酶催化
-CH3
碱基交换 Q
tRNA鸟嘌呤 糖苷转移酶
G34 (tRNA) Q Q34 (tRNA) Gua
N- 糖苷键打断、重建
b. DNA • ~10 种 甲基化 • 形成 合成时om5dC参入 phage T 2.4.6 合成后甲基化 m5dC m6dA m4dC DNA 甲基化酶 S-腺苷甲硫氨酸（甲基供体）
• 核糖的脱水反应
酸性条件下，核糖或脱氧核糖脱水产物与 试剂反应生成有色物质。可用定糖法比色测定 DNA or RNA 含量。 • 苔黑酚法测RNA 核糖 -3H O 糠醛
2
• 二苯胺法测 DNA 脱氧核糖-2H O ω- 羟基 -γ- 酮基戊醛
2
六. 核酸组分的分离鉴定
1. 分离 a. 电泳分离 Nt and dNt Nt (dNt ) 的解离及pK值 pH3.5 ， Nts 间净电荷 差异最大.
产物
酸
稳 大 定 ￬ 性 小
2. β-消除反应 连接磷酸基团的 β-C 原子上有强的吸电子基团存 在时, 引起 α-C 原子和 O 原子间的键断裂。 OH R– P– O– CH2– CH2– Z (–CHO, >C=O , –HC=N< ) O α β
DNA and RNA 化学法测序 主链断开
基本的化学组成经不同程度水解可获得核酸各种组成部分核苷酸nucleotident核苷nucleosidens碱基嘌呤purinepu嘧啶pyrimidinepy碱基三字符号adecytguathyurans单字符号nsntoligonts中均为d戊糖碱基可异构化异构平衡仅原子位置变化uvnmr分析生理ph条件下5种碱基9999氨基亚胺n糖苷键连接oligo表示法polypolydadt交替排列polydadt随机排列polya2poly抗生素抗生素第二信使第二信使嘌呤霉素嘌呤霉素细胞激动素细胞激动素能源库能源库辅酶辅酶糖环的折叠形式构型configuration共价化合物中各个原子在空间的相对排列关系
碱基可异构化 异构平衡仅 H 原子位置变化 UV,NMR分析 生理 pH 条件下, 5种碱基 99.99% 以 氨基与酮式存在。
酮式
烯醇式
氨基
亚胺
N-糖苷键
C1 与嘧啶 N1 连接 C1 与嘌呤 N9 连接
oligo 表示法 poly U 均聚物 poly (dA-dT) 交替排列 poly (dA· dT) 随机排列 poly A· 2poly U 按1:2结合成复合物 (三链)
侧视图
内式 外式
2. 扭转式 ( Twist, T ) 糖环的 C2’ 和 C3’ 两个原子都偏离糖平面, 而且取方向相反的折叠。 两个原子偏离糖平面的程度可以相等或不等 侧视图 C2’-endo-C3’-exo C2’-exo-C3’-endo
• 存在 溶液 : Nt , Ns C2’-endo ~ C3’-endo DNA : B-DNA C2’-endo A-DNA(RNA) C3’-endo Z-DNA 胞苷(C) C2’-endo ( 反式） 鸟苷(G) C3’-endo（顺式 ）
一条X-染色体的失活
• 甲基化格式的建立、维持和改变 从无到有(de novo)甲基化 双链相对-CpG-mCpG- 确立新格式
甲基化的维持 脱甲基 被动 主动
复制后不再甲基化 甲基转移 碱基切除修复
• CpG-rich islands 基因组中存在异常非甲基化-CpG-顺序簇 高含量 C+G 高频率 CG dimer (10/100bp ) 分布不均, 长1-2 kb，间隔 ~100 kb 非甲基化 –CpG 存在：housekeeping genes tissues specific genes 5’- 启动子——转录区
ADP质子化状态
b. 层析 • 离子交换层析 高效液相层析 ( HPLC ) • 稀有成分纤维素薄板双向层析 灵敏, 快速, 稳定。 20种 3’- Nt, 22种 5’- Nt, 40种 Ns, 14种抗水 解 NmNp dimer. AmGp ~GmAp CmUp ~ UmCp
2. 鉴定 a. 标准品对照(电泳,层析) UV吸收检出 吸收 UV蓝紫色斑点, G蓝色荧光, D无吸收。
C2’-endo
四. 核酸的修饰成分及甲基化 1948年 小牛胸腺DNA分离 m5dC 特点: • 原有成分的衍生物 • 含量少(百分之几~万分之几) • 主要化学键不变
1.修饰碱基 60余种 Ura Ade Gua Cyt Thy 25 17 12 6 2 • 碱基上原子被其他基团取代 m p om …… • AA衍生物 Base-CO-NH-AA • 糖衍生物 Base-CH2OH-糖(6C) • 非嘌呤,嘧啶衍生物 ( tRNA )
CpG密度 1/100bp
腺嘌呤磷酸核糖 转移酶
CpG密度 10/100bp –100 ~ 300
1
2
3 1. 二氢叶酸还原酶基因 2. 次黄嘌呤转磷酸核糖酶基因 3. 核糖体蛋白质基因
CG mCG
DNA甲基化有助于基因关闭
抑制转录的蛋白质
MeCP-1 MeCP-2 *CpG 成簇 *CpG
5. 分布 a. RNA ~70 • mRNA ( hnRNA mRNA ) 5’-Cap: m7G Nm 分子内: m6A m5C • rRNA 原核 m5C 真核 Nm mN Ψ 高度修饰成分( m1ncp3Ψ ) Hela cell 28S rRNA 65Nm ( 70 ) 18S rRNA 40Nm 6mN
五. 核酸及其化学组分的化学反应 1.水解反应 磷酸二酯键, 磷酸单酯键, N-糖苷键 a. 酶水解 b. 酸碱水解 • 磷酸二酯键 • 酸 热强酸 dA,dG 0.1NHCl 30mi （100°C)
rA,rG 1M HCl 60min rC, rU 12M HClO4 60min • 碱 DNA 不作用 RNA 邻接基团参与效应,生成磷酸 基转移中间物,水解。
b. 卤化反应
嘧啶 5 位 卤素分子 嘌呤 8 位 8-BrPu 标记 5-FU 抗癌药
c. 与醛类反应 碱基的环外 –NH2
AMP: N6-NH2
GMP: N2-NH2
甲醛是DNA不可逆变性剂 •鉴定 ssDNA or dsDNA •破坏RNA高级结构，消除结构对电泳迁移 率的影响
d. 核糖上的反应 • 核糖的氧化反应 核糖的2’，3’-顺二醇被高碘酸( HIO4)氧 化成顺二醛，胺催化 β-消除反应，同时碱基 脱落, 生成磷酸，碱基和糖碎片。 5’-Nt 定量测定 RNA 序列测定