传染性造血器官坏死病毒环介导等温扩增检测方法的建立和初步应用
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(１������ Ｂｅｉｊｉｎｇ Ａｑｕａｔｉｃ Ｗｉｌｄｌｉｆｅ Ｒｅｓｃｕｅ ａｎｄ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０２１００ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２������ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｆｅｎｇｙａｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ Ｓｃｈｏｏｌꎬ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５００００ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｏｕｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｈａｅｍａｔｏ￣ ｐｏｉｅｔｉｃ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ( ＩＨＮＶ) ｉｎ ｂｏｔｈ ｏｆ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ ｆｉｅｌｄ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ������ Ａ ｓｅｔ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ＩＨＮＶ Ｎ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ������ ＩＨＮＶ ＲＮＡ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｆｏｒ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｉｎ ａ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ ｃｏｎ￣ ｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ａｎｄ Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ������ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｇｒｅｅｎ ｃｏｌｏｒ ｗｈｅｒｅａｓ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ａ ｒｅｄｄｉｓｈ ｂｒｏｗｎ ｃｏｌｏｒ������ Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ６４ ℃������ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｅｓｔｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｃａｐａｂｌｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ＩＨＮＶ ｈａｄ ｎｏ ｃｒｏｓｓ ａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＳＶＣＶꎬ ＨＲＶꎬ ＶＨＳＶ ａｎｄ Ｈ２ Ｏ������ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｄｅｔｅｃｔ １������ ０ × １０ －４ μｇ / μＬ ＩＨＮＶ ＲＮＡ������ Ｉｎ ｓｕｍｍａｒｙꎬ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｆｉｅｌｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＨＮＶ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ｐｅｒｆｏｒｍ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｏｆ ｍａｓｓ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙꎬ ｒａｐｉｄｉｔｙꎬ ｓｉｍｐｌｅꎬ ｌｏｗ ｃｏｓｔꎬ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｒｅｌｙｉｎｇ ｏｎ ａｎｙ ｓｐｅｃｉａｌ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ������ Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓꎻ ｔｒｏｕｔꎻ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻ Ｎ ｇｅｎｅ
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｈａｅｍａｔꎬ ＣＨＥＮ Ｙｉ￣ｊｉｎｇ２ ꎬ ＳＨＩ Ｘｉａｏ１ ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｂａｏ￣ｌｉ１ ꎬ ＷＥＮ Ｚｈａｎ￣ｈｕａ１ ꎬ ＣＨＥＮ Ｃｈｕｎ￣ｓｈａｎ１ ꎬ ＬＩ Ｂｏ１ ꎬ ＤＵ Ｙｉｎｇ￣ｃｈｕｎ１
传染性造血器官坏死病( ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉ￣ ｅｔｉｃ ｎｅｃｒｏｓｉｓꎬＩＨＮ) 是极易对冷水鱼养殖造成严重 危害的鱼类急性全身性传染病ꎬ 是世界动物卫生组 织( ＯＩＥ) 规定必须申报的动物疫病ꎬ 我国农业部也
淡水渔业ꎬ ２０１９ꎬ ４９(３) : ６６ － ７０ Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ
２０１９ 年 ５ 月 Ｍａｙ������ ２０１９
传染性造血器官坏死病毒环介导等温扩增 检测方法的建立和初步应用
何亚鹏１ ꎬ 陈怡静２ ꎬ 时 晓１ ꎬ 张宝莉１ ꎬ 温战华１ ꎬ 陈春山１ ꎬ 李 博１ ꎬ 杜迎春１
(１������ 北京市水生野生动植物救护中心ꎬ 北京 １０２１００ꎻ ２������ 郑州外国语新枫杨学校ꎬ 郑州 ４５００００)
摘要: 实验建立了一套反转录环介导等温扩增方法( ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬＲＴ￣ ＬＡＭＰ) ꎬ 用于实验室及现场检测鲑鳟鱼传染性造血器官坏死病毒( ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓꎬＩＨＮＶ) ꎮ 针对 ＩＨＮＶ 的核蛋白基因设计特异性引物ꎬ 以 ＩＨＮＶ 基因组 ＲＮＡ 为模板ꎬ 在反转录酶及 Ｂｓｔ ＤＮＡ 聚合酶的作用 下进行反转录 ＬＡＭＰꎬ 结果阳性样本表现为荧光绿色ꎬ 阴性样本仍为红棕色ꎮ 反应条件优化结果表明最适反应温 度为 ６４ ℃ ꎻ 特异性试验表明仅 ＩＨＮＶ 发生特异性扩增ꎬ 而 ＳＶＣＶ、 ＨＲＶ、 ＶＨＳＶ 和 Ｈ２ Ｏ 均不发生反应ꎻ 敏感性试 验表明该 ＬＡＭＰ 方法可检出浓度为 １������ ０ × １０ －４ μｇ / μＬ 的 ＩＨＮＶ 核酸ꎮ 本研究所建立的 ＩＨＮＶ 反转录 ＬＡＭＰ 检测法 成本低、 操作简单、 反应迅速、 不依赖专门的仪器ꎬ 同时具有较高的灵敏度和特异性ꎬ 适合 ＩＨＮＶ 的现场检测和 大批量样品的检疫ꎮ 关键词: 传染性造血器官坏死病毒ꎻ 鲑鳟ꎻ 环介导等温扩增ꎻ 核蛋白基因 中图分类号: Ｓ９４１������ ４１ 文献标识码: Ａ 文章编号: １０００￣６９０７￣(２０１９)０３￣００６６￣０５
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｏｕｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｈａｅｍａｔｏ￣ ｐｏｉｅｔｉｃ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ( ＩＨＮＶ) ｉｎ ｂｏｔｈ ｏｆ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ ｆｉｅｌｄ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ������ Ａ ｓｅｔ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ＩＨＮＶ Ｎ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ������ ＩＨＮＶ ＲＮＡ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｆｏｒ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｉｎ ａ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ ｃｏｎ￣ ｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ａｎｄ Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ������ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｇｒｅｅｎ ｃｏｌｏｒ ｗｈｅｒｅａｓ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ａ ｒｅｄｄｉｓｈ ｂｒｏｗｎ ｃｏｌｏｒ������ Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ６４ ℃������ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｅｓｔｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｃａｐａｂｌｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ＩＨＮＶ ｈａｄ ｎｏ ｃｒｏｓｓ ａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＳＶＣＶꎬ ＨＲＶꎬ ＶＨＳＶ ａｎｄ Ｈ２ Ｏ������ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｄｅｔｅｃｔ １������ ０ × １０ －４ μｇ / μＬ ＩＨＮＶ ＲＮＡ������ Ｉｎ ｓｕｍｍａｒｙꎬ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｆｉｅｌｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＨＮＶ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ｐｅｒｆｏｒｍ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｏｆ ｍａｓｓ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙꎬ ｒａｐｉｄｉｔｙꎬ ｓｉｍｐｌｅꎬ ｌｏｗ ｃｏｓｔꎬ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｒｅｌｙｉｎｇ ｏｎ ａｎｙ ｓｐｅｃｉａｌ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ������ Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓꎻ ｔｒｏｕｔꎻ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻ Ｎ ｇｅｎｅ
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｈａｅｍａｔꎬ ＣＨＥＮ Ｙｉ￣ｊｉｎｇ２ ꎬ ＳＨＩ Ｘｉａｏ１ ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｂａｏ￣ｌｉ１ ꎬ ＷＥＮ Ｚｈａｎ￣ｈｕａ１ ꎬ ＣＨＥＮ Ｃｈｕｎ￣ｓｈａｎ１ ꎬ ＬＩ Ｂｏ１ ꎬ ＤＵ Ｙｉｎｇ￣ｃｈｕｎ１
传染性造血器官坏死病( ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉ￣ ｅｔｉｃ ｎｅｃｒｏｓｉｓꎬＩＨＮ) 是极易对冷水鱼养殖造成严重 危害的鱼类急性全身性传染病ꎬ 是世界动物卫生组 织( ＯＩＥ) 规定必须申报的动物疫病ꎬ 我国农业部也
淡水渔业ꎬ ２０１９ꎬ ４９(３) : ６６ － ７０ Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ
２０１９ 年 ５ 月 Ｍａｙ������ ２０１９
传染性造血器官坏死病毒环介导等温扩增 检测方法的建立和初步应用
何亚鹏１ ꎬ 陈怡静２ ꎬ 时 晓１ ꎬ 张宝莉１ ꎬ 温战华１ ꎬ 陈春山１ ꎬ 李 博１ ꎬ 杜迎春１
(１������ 北京市水生野生动植物救护中心ꎬ 北京 １０２１００ꎻ ２������ 郑州外国语新枫杨学校ꎬ 郑州 ４５００００)
摘要: 实验建立了一套反转录环介导等温扩增方法( ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬＲＴ￣ ＬＡＭＰ) ꎬ 用于实验室及现场检测鲑鳟鱼传染性造血器官坏死病毒( ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓꎬＩＨＮＶ) ꎮ 针对 ＩＨＮＶ 的核蛋白基因设计特异性引物ꎬ 以 ＩＨＮＶ 基因组 ＲＮＡ 为模板ꎬ 在反转录酶及 Ｂｓｔ ＤＮＡ 聚合酶的作用 下进行反转录 ＬＡＭＰꎬ 结果阳性样本表现为荧光绿色ꎬ 阴性样本仍为红棕色ꎮ 反应条件优化结果表明最适反应温 度为 ６４ ℃ ꎻ 特异性试验表明仅 ＩＨＮＶ 发生特异性扩增ꎬ 而 ＳＶＣＶ、 ＨＲＶ、 ＶＨＳＶ 和 Ｈ２ Ｏ 均不发生反应ꎻ 敏感性试 验表明该 ＬＡＭＰ 方法可检出浓度为 １������ ０ × １０ －４ μｇ / μＬ 的 ＩＨＮＶ 核酸ꎮ 本研究所建立的 ＩＨＮＶ 反转录 ＬＡＭＰ 检测法 成本低、 操作简单、 反应迅速、 不依赖专门的仪器ꎬ 同时具有较高的灵敏度和特异性ꎬ 适合 ＩＨＮＶ 的现场检测和 大批量样品的检疫ꎮ 关键词: 传染性造血器官坏死病毒ꎻ 鲑鳟ꎻ 环介导等温扩增ꎻ 核蛋白基因 中图分类号: Ｓ９４１������ ４１ 文献标识码: Ａ 文章编号: １０００￣６９０７￣(２０１９)０３￣００６６￣０５