黄曲霉 M1

酶联免疫法定量检测黄曲霉毒素M1
摘要
Helica aflatoxin M1 assay kit（编号：961AFLM01M）竞争酶联免疫分析法定量检测牛奶、奶粉、奶酪和加工食品中的黄曲霉毒素M1。

试剂盒中包含有酶联免疫试验所需的所有试剂，包括标准溶液。

试剂盒足够进行96次检测（包括标准）。

定量检测需要微孔板酶标仪。

样品处理：鲜奶………………………………………….……不需要处理
奶粉………………………………………….……还原成液态奶
奶酪、加工食品…………………………………甲醇水溶液提取
试验时间：样品制备（以10个样品为例）
鲜奶………………………………………………….…不需要处理
奶粉………………………………………….…….……约10分钟
奶酪、加工食品…………………………………………约30分钟
检测时间……………………………………………………约3小时
（与样品数量无关）
检测限：5ppt
回收率：80 - 100%
1. 用途
Helica Aflatoxin M1 assay kit是竞争酶联免疫分析法定量检测牛奶、奶粉、奶酪和加工食品中的黄曲霉毒素M1。

2. 概要
黄曲霉毒素是主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的次生代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。

黄曲霉毒素是一种强烈的致癌物，而且是曲霉菌等菌类的高毒代物，而黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1的代谢物，当奶牛被饲养被污染的饲料后，黄曲霉毒素B1通过羟基化作用转化成黄曲霉毒素M1，进而污染牛奶。

黄曲霉毒素M1结构稳定，在牛奶加工过程中甚至是巴氏消毒都无法将其去除，直至最后被人体摄入。

大多数政府机构都对人体和动物可摄入的黄曲霉毒素量有严格的法规限制。

很多国家已经对牛奶和乳制品中的黄曲霉
毒素M1含量有了限量标准。

在欧盟，牛奶和奶粉中的黄曲霉毒素M1含量被限制在0.05 mg/L 或50ppt。

Helica Aflatoxin M1 assay kit检测试剂盒则能够提供快速而准确的分析。

3. 测定原理
测定的基础是抗原抗体反应。

微孔板包被有针对黄曲霉毒素M1的特异性单克隆抗体。

加入黄曲霉毒素标准或样品溶液、黄曲霉毒素酶标记物，游离黄曲霉毒素与黄曲霉毒素酶标记物竞争黄曲霉毒素抗体（竞争性酶联免疫分析法）。

没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去。

将基质/发色剂加入到孔中并且孵育。

结合的酶标记物将基质/发色剂转化为蓝色的产物。

加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。

在450nm处测量，吸收光强度与样品中的浓度成反比。

4.提供的试剂
每一个盒中的试剂足够进行96个试验（包括标准测定孔），盒中的材料如下
1×96孔板（12条×8孔，可以拆分为单孔）包被有黄曲霉毒素M1单克隆抗体。

6×黄曲霉毒素M1标准溶液，3.0ml/瓶……………………………………………………白色盖0 ppb （0标准）, 5 ppt, 10 ppt, 25 ppt, 50 ppt, 100 ppt
黄曲霉毒素M1脱脂奶溶液，直接应用
1×酶标记物（15ml）………………………………………………………………….……绿色盖过氧化物标记的黄曲霉毒素M1，直接应用
1×底物/发色剂（15ml）………………….………………………………………….….…..蓝色盖红色溶液
1×反应终止液（15ml）……...……………….………………………………………….….红色盖包含有1N硫酸
1×洗涤缓冲液（盐）
10mM的磷酸盐缓冲液（pH 7.4），含有0.05 % 的Tween 20
1×空白脱脂奶（15ml）……...……………….………………………………………….….白色盖用于奶酪和加工食品样品提取
5.需要的材料但盒中不提供
5.1设备
—微孔板酶标仪（450nm）
—100ml量筒（塑料或是玻璃）
—样品提取用玻璃容器：过滤漏斗和烧瓶
—离心机
—振荡器
—滤纸：Whatman No.1或是相当的滤纸
—刻度移液管
—100μl，200μl，1000μl微量加样器
5.2 试剂
—甲醇
—70%的甲醇溶液：制备70%的甲醇溶液用70ml甲醇与30ml蒸馏水或去离子水混合—蒸馏水或去离子水
6.操作者应该注意之事项
严格按照说明书中规定的温度和时间进行试验。

不要将未用完的试剂倒回原来的瓶子中。

待检样品的pH值应保持在7.0（±1.0），过酸或过碱都可能对结果产生影响。

不要交换使用不同批号的盒中试剂。

不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度的降低。

标准液含有黄曲霉毒素M1，应避免溶液接触皮肤（要带手套）。

使用过的玻璃容器及黄曲霉毒素M1溶液最好用次氯酸溶液（10% v/v）浸泡过夜（用HCl调整溶液至pH 7）。

反应终止液含有1N硫酸，避免接触皮肤。

7.储存条件
保存试剂盒于2 - 8°C (35 – 46°F)，不要冷冻。

将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封。

黄曲霉毒素M1对光敏感，因此要避免暴露在光线下。

底物/发色剂对光敏感，因此要避光保存。

8.试剂变质的迹象
无色的底物/发色试剂出现任何蓝色，表明基质/发色剂变质，应当弃之。

0标准的吸光度值小于0.6个单位(A450nm<0.6)时，表示试剂可能变质。

9.样品处理
鲜奶：不需要处理直接应用
奶粉：按产品说明要求还原成液态奶，或1：10稀释
注：如需要提高实验精确度，可将鲜奶和奶粉复原液用冷冻离心机（3500g 2-8℃）离心10分钟去除脂肪；如没有冷冻离心机，可将样品先冷却到2-8℃，再离心。

奶酪：
—取1克充分研磨好的或者浸软的奶酪至离心管中，加入5ml甲醇，充分混合5分钟，离心（5,000g，5 分钟）取上清液。

—取0.5 mL上清液至一个玻璃管中并进行干燥（可在氮吹仪中进行）。

该过程导致玻璃管内有半固体粘稠状残留。

加入0.5 mL试剂盒中提供的空白脱脂奶至玻璃管中，并强烈振荡1分钟充分溶解，静置5分钟，取200 ul该提取液进行检测。

根据需要可以改变样品量，但甲醇溶液的量也应相应增加。

如10g样品加入50ml甲醇。

注意：
如果样品溶液中的黄曲霉毒素含量较高，则需要进一步稀释。

10.检测步骤
10.1 试验前准备
1. 使用之前将所有试剂回升至室温(20 - 25°C, 68 - 77°F)。

2. 使用之后立即将所有试剂放回2 - 8°C (35 – 46°F)。

3. 在使用中不要让微孔干燥，尽量避免间隔时间过长。

4. 在EIA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是EIA测定程序中的要点。

5. 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，建议用盖子盖住微孔。

10.2被有抗体的微孔板条
将锡箔袋回至室温后，沿横向边压封线外侧剪开，取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板立即放回原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2 - 8°C (35 – 46°F)。

注意：洗板推荐使用多道移液器，以保证每孔孵育时间相同。

如果用单道移液器，推荐每次最多不要超过16个样品和标准品（2条）。

10.3 洗涤缓冲液
试剂盒中含有一包缓冲盐（4.），用1L蒸馏水完全溶解。

配制好的洗涤缓冲液在2 - 8°C (35 –46°F)下可保存4-6周。

另外：用100ml的蒸馏水溶解1包洗涤缓冲液干粉，可以得到10倍洗涤缓冲液，在室温（20 - 25°C, 68 - 77°F）下10倍的洗涤缓冲液可以保存8-12周。

取1份10倍的洗涤缓冲液，取9份的蒸馏水混合，可配制直接使用的洗涤缓冲液。

10.4测定程序
1. 将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准及样品做平行，并记录标准及样品的位置。

2. 加入200µl的标准品（白色盖）或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头，盖住微孔板在室温下（20 - 25°C, 68 - 77°F）孵育2小时。

3. 倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。

用洗瓶或多通道移液器将250µl洗涤缓冲液加入孔中，小心地使酶标板在平面上做圆周运动。

再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，再重复操作洗涤步骤三次
4. 加入100µl酶标记物（绿色盖）到微孔，小心地使酶标板在平面上做圆周运动以充分混合。

在室温下（20 - 25°C, 68 - 77°F）孵育15分钟。

5. 倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。

用洗瓶或多通道移液器将250µl洗涤缓冲液加入孔中，小心地使酶标板在平面上做圆周运动。

再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，再重复操作洗涤步骤三次。

6. 加入100µl底物/发色剂（蓝色盖）到微孔中，充分混合并在室温（20 - 25°C, 68 - 77°F）暗处孵育15分钟。

7. 加入100µl反应停止液（红色盖）到微孔中充分混合。

混合好在450nm处测量吸光度值，以空气为空白，必须在加入停止液后5分钟内读取光度值。

11. 结果
所获得的标准和样品吸光度值除以第一个标准(0标准)的吸光度值再乘以100。

因此0标准等
于100%并且以百分比给出吸光度值。

标准（或样品）的吸光度值
×100 = %吸光值
0标准的吸光度值
计算的标准值绘成为一个对应黄曲霉毒素浓度(µg/kg)的半对数坐标系统曲线图，在标准曲线上5 - 100 ng/kg (ppt)一段范围内呈线性。

为了得到样品中黄曲霉毒素M1的真正浓度，从校正曲线上读取的数据需要乘以相应的稀释倍数。

牛奶样品稀释倍数为1，奶酪稀释倍数为5。

12．回收率和再现性
往牛奶中添加50 ppt 标准品，回收率如下：
奶酪中的回收率：
1mg搓碎的干酪添加100 pg 黄曲霉毒素M1，室温静置1小时。

按照以上提取步骤进行提取和检测，8个添加样品黄曲霉毒素M1回收率为70.5%，CV为5.5%。

13. 灵敏度
14. 精确度
14.1批内差异
14.2批间差异：
超过7个月多个不同批号试剂盒。