原生质体融合技术简介
植物原生质体融合技术
要点二
细胞大规模培养
通过改进细胞培养技术，可以实现植物原生质体融合后细 胞的规模化培养，为快速繁殖和生产转基因植物提供有效 手段。
生物反应器与细胞工厂的优化
生物反应器设计
针对植物原生质体融合过程，可以设计和优 化生物反应器，实现融合过程的自动化和连 续化，提高融合效率和细胞质量。
细胞工厂构建
通过优化生物反应器中的培养条件和工艺参 数，可以构建高效细胞工厂，实现植物原生
技术应用领域
新品种培育
通过原生质体融合技术，可实现不同品种间 优良性状的整合，快速培育出新品种。
基因功能研究
通过原生质体融合技术，可研究植物细胞中 基因的表达和功能。
抗性改良
利用该技术改良植物的抗逆性，如抗旱、抗 病、抗虫等。
细胞器与细胞生物学研究
该技术可用于研究细胞器的结构和功能，以 及细胞分裂、分化的过程。
原生质体的诱导融合
电融合法
利用电场作用诱导原生质体融合，通 常在特定的电融合装置中进行，需要 在特定的电场强度和脉冲时间下进行 操作。
化学融合法
利用化学物质如聚乙二醇（PEG）等 诱导原生质体融合，通过调节PEG浓 度、pH值等参数来控制融合过程。
融合后细胞的筛选与培养
筛选
通过特定的筛选方法如荧光染色、抗性筛选等，从融合后的细胞群体中筛选出 具有优良性状的细胞。
植物原生质体融合技术
目录
CONTENTS
• 植物原生质体融合技术概述 • 植物原生质体融合技术的基本原理 • 植物原生质体融合技术的应用 • 植物原生质体融合技术的挑战与前景 • 案例研究 • 技术展望
01
CHAPTER
植物原生质体融合技术概述
定义与特点
原生质体融合技术
原生质体融合技术的局限性植物原生质体是指用特殊方法去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生团。
这种裸露细胞在适当的外界条件下，还可形成细胞壁，进行有丝分裂，形成愈伤组织和诱发再生植株，因而仍然具有细胞的全能性。
植物原生质体融合技术是借鉴于动物细胞融合的研究成果，在原生质体分离培养的基础上建立起来的，以植物的原生质体为材料，通过物理、化学等因素的诱导，使两个原生质体融合在一起以致形成融合细胞的技术。
它不是雌雄孢子之间的结合，而是具有完整遗传物质的体细胞之间的融合，是2种原生质体间的杂交。
通过原生质体融合可以把带有不同的基因组的两个细胞结合在一起，与有性杂交相比，无疑可以使“杂交”亲本组合的范围扩大，不但可以利用细胞核内基因资源，还可以利用包含在细胞质中的诸如叶绿体和线粒体DNA的遗传资源。
原生质体培养是细胞杂交的基础，但是直到目前为止，也只有360多个种的原生质体培养再生了完整的植株，大多数重要的植物尤其是木本植物如葡萄、棕榈、橡胶、茶、香蕉、椰子和芒果等的原生质体再生仍然很困难，或者还未进行深入研究。
在原生质体再生的物种中，茄科占了将近1/4，并且用于育种目的的大多数体细胞杂种和细胞质杂种也比较集中于茄属、烟草属、苜蓿属、柑橘属、芸薹属和番茄属等6个属中。
因此，为了有效地进行植物遗传改良，不但要使杂种细胞再生成完整植物，而且还必须提高植株再生的频率，以便有足够的群体进行有效的选择。
但目前存在的一个普遍的问题使许多原生质体再生的程序似乎较低，重复性较差，并且还具有基因型的依赖性。
为了将体细胞杂交技术应用于更多的植物中，还需要更加深入地研究植物细胞的分化、脱分化和再分化等发育机制。
1.技术局限性植物细胞杂交的本质是将两种不同来源的原生质体，在人为的条件下进行诱导融合。
由于植物细胞的全能性，因此融合之后的杂种细胞，可以再生出具有双亲性状的杂种植株。
因此，细胞融合也叫原生质体融合或细胞杂交。
其包括三个主要环节：诱导融合；选择融合体或杂种细胞；杂种植株的再生和鉴定。
食用菌原生质体融合育种技术简介
食用菌原生质体融合育种技术简介原生质体（protoplast）这个术语最早是由Hanstein 在1880年提出来的。
确切地说，食用菌原生质体是指细胞壁完全消除后余下的那部分包裹的裸露的细胞结构。
原生质体虽然失去了细胞壁存在时的原有细胞形态，变成了圆球体，但它仍然具有原生质膜和整体基因组，是一个具有生理功能的单位。
食用菌原生质体融合（protoplastfusion）是指通脱壁后的不同遗传类型的食用菌菌株原生质体，在融合剂的诱导下进行融合，最终达到部分或者整套基因组（核基因、线粒体基、胞质基因）的交换和重组，生产出新的食用菌品种和类型，也就是说，食用菌原生质体融合育种技术上是一种不通过有性生活史（sexualcycle）而达到遗传重组或有性杂交的育种手段。
近日，在佛山科技学院召开的“草菇原生质体融合育种研究”成果鉴定会上获悉，该院农学系利用现代生物工程原生质体融合育种技术，成功地选育出草菇新品种Ｖｐ—２、Ｖｐ—３。
专家们实地考察后认为，该研究成果数据可靠，技术新颖，品种表现良好，种性稳定，菌丝生长健壮，爬料速度快，抗杂能力强，子实体结实，基部紧凑，个体适中，兼备双亲优良性状，生物特性明显优于目前生产使用的当家品种。
鉴定专家一致认为，该研究成果居于国内领先水平。
据项目鉴定委员会主任、省微生物研究所研究员丘元盛介绍，该项目成果具有技术的前瞻性和研究的独创性：采用超声波处理结合溶壁酶酶解，很好地解决了草菇细胞壁裂解的难题，为原生质体融合育种提供了大量原生质体，完善了草菇原生质体制备和融合技术；创造性地利用不同草菇品种间存在拮抗作用进行融合子初筛，利用不同草菇种间分解脱脂牛奶、可溶性淀粉、聚半乳糖醛酸等物质的能力差异性，定量检测融合子与亲本间的酶分解能力，通过ＤＮＡ随机多态性差异检测进而确定融合子，技术操作新颖，为食用菌育种开辟新途径；开创性采用液氮研磨与溶壁酶酶解相结合提取草菇菌丝ＤＮＡ技术，获得高纯度遗传物质，圆满解决草菇等真菌ＤＮＡ提取过程中破壁困难和纯度不高等技术难题，实现现代分子生物学水平格测融合子的技术性飞跃。
植物原生质体融合的方法
植物原生质体融合的方法
植物原生质体融合技术是一种准确、灵活和快速的分子育种技术，它可以将一种植物中的遗传物质与另一种植物的遗传物质融合在一起，以获得更有效的育种方法。
下面介绍植物原生质体融合技术的基本概念和其应用：
一、植物原生质体融合技术的基本概念
1、原生质体的定义：原生质体（Protoplast）是指细胞原有的稳定的液体质结构，在植物细胞当中占据重要的分子物质，可以被用来搅拌，冷冻，施主或克隆植物细胞的核酸，蛋白质以及其他的分子物质。
2、破壁法的原理：破壁法是一种用于分离出植物原生质体的方法，它利用酶和/或静电力，这种酶使细胞壁细胞可以被剥离出来，从而形成原生质体。
3、原生质体融合技术：原生质体融合技术就是利用破壁法将不同植物的原生质体融合起来，以获得新的基因组的遗传材料，从而为植物的育种提供了新的思路。
二、植物原生质体融合技术的应用
1、引入新基因：原生质体融合技术可以有效地引入一些新的基因材料到植物细胞，从而改变植物的性状特征，从而获得抗逆性、抗病性、烘焙品质和其他重要特征，使植物更适应环境条件。
2、突变：通过将不同植物原生质体融合起来，可以引发基因突变，从
而获得新的外观形状或性状，更好地提高植物的繁殖力和适应性。
3、抗逆育种：原生质体融合技术可以有效地增强植物细胞体抗病性和抗逆性，从而大大提高植物的耐受性，使一些极端的环境能够更好地适应植物的生长和发育。
总而言之，植物原生质体融合技术旨在将宿主植物中基因携带的遗传改良物质融入受体细胞中，以获得更多优良育种材料，从而提高植物的适应性和抗逆性，从而提升作物的产量。
第六章 原生质体融合
2 高pH(10.5)-高Ca离子法
1973年：Keller和Melchers用pH10.5的 50 mMCaCl2溶液在37℃时，诱 发烟草叶肉原生质体融合。 优点：杂种产量高。 不足：高pH值对细胞有毒害作用。
细胞质杂种
细胞质杂种只具有一个亲本的细胞核，而具 有两个亲本细胞质的遗传物质，细胞质杂种可用 来转移细胞质基因所决定的遗传性状，如胞质雄 性不育基因，抗除草剂基因及其对某些抗生素抗 性的特征，以及一些光合作用有关的特征，均可 通过胞质杂种来转移这些优良基因，因而在遗传 育种中具有重要意义。
非对称杂交是一亲本的细胞核和细胞质与另一 亲本的少量核物质(1～2条染色体)和全部细胞 质融合； 细胞质杂交是一亲本的细胞核和细胞质及另一 亲本的全部细胞质融合，可能使两种来源不同 的核外遗传成分(细胞器)与一个特定的核基因 组结合在一起，这种杂种叫细胞质杂种。
植物+植物 植物+动物 动物+酵母
PEG法原理
PEG是一种带负电性的高分子化合物， 在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以 使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被 洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜 大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原 生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正 性电荷部位相连而导致融合。
原生质体的融合过程包括3个主要阶段：
1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近； 2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合； 3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。
①凝聚作用阶段：
两个或两个以上原生 质体膜彼此靠近
②小区域融合阶段：
第二节原生质体融合育种
第二节原生质体融合育种一. 原生质体融合育种的特点原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇(PEG) 助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合，接着发生两套基因组之间的接触、交换，从而发生基因组的遗传重组，就可以在再生细胞中获得重组体。
原生质体融合技术具有7 个方面的优点：杂交频率较高：由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融合时又加入了融合促进剂PEG ，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法。
已知霉菌与放线菌的融合频率为10 -3 ～10-1，细菌与酵母的融合频率亦达到10 -3 ～10-6。
受接合型或致育性的限制较小：由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。
另外，由于原生质体融合是和“性”没有关系的细胞杂交，所以其受接合型或致育性的限制比较小。
重组体种类较多：由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发生相互接触，可以有机会发生多次交换，所以可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组体。
遗传物质的传递更为完整：由于原生质体融合是两个亲株的细胞质和细胞核进行类似合二为一的过程，因此遗传物质的交换更为完整。
原核微生物中可以得到将两个或更多个完整的基因组携带到一起的融合产物，放线菌中甚至能形成短暂或拟双倍体的融合产物，而在真菌中能形成短暂的或稳定的杂合二倍体甚至三倍体或四倍体等多倍体。
可获得性状优良的重组体：与其它的育种方法相结合，将从其它方法获得的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。
例如，唐沢昌彦等将氨基酸生产菌AJ3419(AEC r+ile-)与Bl-4(AHV r +lys-) 的原生质体融合，获得了苏氨酸高产菌AJ11812(AEC r+AHV r+ile-+lys-) ，该菌的苏氨酸产量较亲株提高了1 倍。
原生质体融合技术简介
作者 Xu
Jin
Khattab
酵母
对铬有较高抗性和除铬性 能较高的两种酵母进行融 合
处理低浓度含铬废水时， 卢显妍 去除率和还原率可达100%， 处理高浓度含铬废水 (200mg/L) 时 ， 还 原 率 达 50%
黑 曲 霉 (Aspergillus niger) 与 阿 特 拉 津 降 解 菌 青 霉(Penicillium sp)
(T.atroviride)
进行融合
豌 豆 根 瘤 菌 (Rhrhizbium
leguminosorum) 和 大 豆 根 瘤
菌
(Sinorhizobium
动物病理组织中发现多核细胞 天花病脓胞周围发现多核细胞 水痘侵害过的皮肤中发现多核细胞 麻疹病人扁桃腺中发现多核细胞 组织培养中发现麻疹病毒能诱导细胞用和成多核体 用副流感病毒诱发细胞融合 探索用硝酸钠诱导植物原生质体融合 用NaNO3进行了烟草种间原生质体融合 以白地霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 发现PEG是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 以曲霉 青霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 巨大芽孢杆菌内株间原生质体融合成功 链霉菌原生质融合并获融合重组子 用PEG+高pH-Ca2+研究原生质体融合 用高pH-Ca2++9℅DMSO与少量PEG获得较高的融合率 原生质体PEG融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 一种新的体内分子育种方法——全基因组改组技术
内容
• 原生质体融合技术及应用发展介绍 • 原生质体融合的具体操作方法
－2－
中国科学院青岛生物能源与过程研究所
第六章 原生质体融合
例如：
猴和小鼠 牛和大肠杆菌 苹果和番茄 马铃薯和番茄 人和小鼠细胞
二、原ห้องสมุดไป่ตู้质体融合的类型
1.依据所选用亲本原生质体的来源可分为：
①体细胞杂交：
双亲的体细胞原生质体进行融合
②配子－体细胞杂交：
融合亲本一个是体细胞原生质体，另一个为性 细胞原生质体。精卵细胞与体细胞原生质体融 合可获得三倍体杂种。
③融合阶段
原生质桥 扩展，融合完 成，形成球形 的异核体或同 核体。
4 电融合法
Senda 1979年首先利用此方法实现原生质体融合
电融合仪中有一个融合室，小室两端装有电极， 一定密度的原生质体悬浮液置于其中。在不均匀交变 电场的作用下，使原生质体彼此靠近、接触，排成一 条链，再给予一个点脉冲，使原生质膜发生可逆性电 击穿，从而导致融合。
植物+植物 植物+动物 动物+酵母
PEG法原理
PEG是一种带负电性的高分子化合物， 在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以 使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被 洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜 大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原 生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正 性电荷部位相连而导致融合。
③配子间原生质体融合：
融合亲本为精卵细胞，精卵细胞的体外融合成
功，标志着高等植物受精过程的研究从此可以
置于人工控制的离体条件下进行。
原生质体融合的类型
2.依据所选用亲本原生质体的来源是否相同：
自发融合（仅限同一物种之内）
诱导融合（指应用某种诱变剂导致原 生质体融合的方法）
诱导融合
对称融合：是指两个完整的原生质体融合， 在融合子细胞内含有两个融合亲本全套染色 体和全部的细胞质。
微生物原生质体融合技术
•1957年 年 1957年，Eddy和Williumson等首次用蜗牛酶酶 年 等首次用蜗牛酶酶 和 等首次用蜗牛酶 解制备了酵母菌的原生质体
•60年代 年代
60年代捷克的 年代捷克的Brno和西班牙的 和西班牙的Salmanca两个研究中心对原 年代捷克的 和西班牙的 两个研究中心对 质体技术做了大量基础性工作 前者主要应用原生质体研 工作， 生质体技术做了大量基础性工作，前者主要应用原生质体研 酵母细胞的生活史与细胞分裂，后者主要研究能够有 生活史与细胞分裂 究酵母细胞的生活史与细胞分裂，后者主要研究能够有 降解丝状真菌细胞壁的溶菌酶。 丝状真菌细胞壁的溶菌酶 效降解丝状真菌细胞壁的溶菌酶。
Company Logo
Logo
2 原生质体的融合
微生物原生质体诱导融合方法主要有
电融合 基于微流控芯片 的细胞融合技术
PEG 结合高 ＋ Ca2＋诱 导法
激光诱导融合 高通量细胞融 合芯片
Logo PEG结合高 2＋诱导法 结合高Ca ＋ 结合高
聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，不同种类微生物对 是一种多聚化合物， 聚乙二醇 是一种多聚化合物 PEG分子质量的要求不尽相同。亲本原生质体制备好后， 分子质量的要求不尽相同。 分子质量的要求不尽相同 亲本原生质体制备好后， 即可进行融合。 即可进行融合。
融合（ 融合（PEG、离心沉淀、电脉冲等） 、离心沉淀、电脉冲等） 融合子的检出（直接检出法和间接检出） 融合子的检出（直接检出法和间接检出） 株的筛选
实用性菌 实用性菌
11
Logo
二、原生质体融合技术的步骤与方法
融合重组体筛选
3
主要步骤
1
双亲本原生质 体制备和再生,
食用菌生产技术 原生质体融合育种
原生质体在固体再生培养基和液体 再生培养基上均能再生，为了获得再生 单菌落，常采用固体再生培养基。
再生培养通常采用双层培养基培养 法，底层体纯化后，要进行适当的稀释， 用血球计数板准确计数每毫升原生质体 的数，然后根据实际再生菌落数，便可 计算出再生率。
原生质体再生率（％）＝
二、食用菌原生质体的基本特点
食用菌细胞外面包着一层坚硬的细胞 壁。这一道天然的“屏障”阻挡着食用 菌细胞间的彼此融合，并给各种遗传操 作带来极大困难。 游离的原生质体是真正的单细胞，在 同一时间内能得到大量的遗传上同质的 原生质体，为遗传学研究及用原生质体 为材料开展食用菌育种提供可能性。
原生质体具有以下几个特点：
原生质体的再生率与再生培养基成分、培养 方法、酶解时间及离心条件有关，一般随 着酶解时间的延长，原生质体的释放量增 多，但由于酶对原生质体膜的破坏作用， 再生率却有所下降。酶解时应以达到所需 原生质体的数量为宜。 较高的离心力及较长时间的离心，均 可引起原生质体的破裂，一般采用2000～ 5000r/min、5～10min的离心条件。
从菌丝体制备原生质体主要有两个优点：
①培养时间短，菌丝体生长均匀 一致，进而从菌丝体中释放的原生质 体，在生理和遗传特性上比较一致。 ②该材料在液体酶液中易分散， 适宜当前用酶解的方法分离原生质体。
由于不同食用菌菌丝生长速度不同， 获取幼龄菌丝体天数也不同。 选取旺盛生长期的菌丝体： 如草菇、银耳一般需要2～3天，平 菇需要3～4天，香菇需要5～6天，双孢 蘑菇需要7～9天，木耳则需要9～11天， 菌丝体培养一般采用液体静止培养法， 每瓶放十余粒玻璃珠，培养期间每天用 手摇1～3次
②间接检出法： 即将融合液涂布在营养丰富的再生 平板上，使亲本菌株和重组子都能再生， 然后，再施加选择因子检出重组子。 间接法虽然费时，但它可以克服某 些有表型延迟作用的遗传标记因直接选 择而产生的干扰作用。
原生质体融合技术概述
3.3灭活的机理 3.4灭活原生质体特点不应用
• 灭活机制 • 目前对灭活原生质体的融合机制还丌很清楚。 • 1）Wright 的损伤互补原则 Wright使用丌同的生化药 剂分别灭活两株动物细胞，融合后得到了活的杂亝细胞， 他认为这是由于两株细胞的致死损伤得到了互补的结果。 Fodor等热灭活带有标记的 B.megaterium 的二个亲株原 生质体，经PEG 诱导后未获得融合子。李焕娄等在研究弗 氏链霉菌的株间灭活原生质体融合时发现，当两亲株的原 生质体分别用热和紫外线，或都用紫外线灭活，然后迚行 融合，而两亲株都用热灭活时，未能获得重组体。这些实 验都支持了Wright 的损伤互补原则。
5、原生质体融合技术应用不展望
• 5.1目前的原生质体融合技术的的应用 具体包括： １）提高产量或质量，合成新物质，如提高抗生素的合成； ２）改良菌种的遗传特性，如酵母菌属间原生质体融合构建 高温酵母菌株和L-异亮氨酸高产菌的原生质体融合育种； ３）优化菌种的发酵特性，如酒精的酿造中的应用； ４）质粒转移； ５）原生质体不细胞核融合； ６）迚行遗传分析
酶解温度对原生质体制备的影响
• 丌同的酶具有各自丌同的最适温度，同时还要注意菌株生 长的最适温度，以避免因温度丌当而导致原生质体活性降 低，甚至破坏，因此确定酶解温度通常要二者兼顾，这对 水解细胞壁是至关重要的。一般酶解温度控制在20~40度。
酶浓度对原生质体制备的影响
• 原生质体形成率在一定范围内不溶菌酶的浓度成正比。当 浓度过高溶菌酶作用于原生质体时，形成率得到提高高， 但溶菌酶中往往含有一些对原生质体有害的酶类（如过氧 化物酶、核糖核酸酶等），因此，当达到一定浓度时，必 然会严重地影响原生质体的活性； • 而且酶量过大会使细菌脱壁太彻底，失去了原生质体再生 时合成细胞壁的引物，易使菌体凝集，降低原生质体的再 生率。
原生质体融合与植物遗传改良的例子
原生质体融合与植物遗传改良的例子
原生质体融合是一种生物技术，可以将两个不同植物的质体（细胞质和细胞核以外的细胞成分）融合在一起，形成一个新的细胞体系。
这种技术可以用于改良植物的性状，如增加植物的抗病性、耐盐性、耐旱性等等。
以下是一些原生质体融合在植物遗传改良中的例子：
1. 水稻的抗病性提高：将拥有良好抗病性的水稻品种的原生质体融合到普通水稻品种上，可以显著提高该水稻品种的抗病能力。
2. 番茄的耐盐性提高：将耐盐性较强的番茄品种的原生质体融合到普通番茄品种上，可以提高该番茄品种的耐盐性，使其能够生长在高盐度的土地上。
3. 油菜的花期延长：将具有较长花期的油菜品种的原生质体融合到其它品种上，可以使其它品种的花期延长，从而延长其生产收获期。
总之，原生质体融合技术可以为植物遗传改良提供新的途径和选择，因此在现代植物育种中得到广泛应用。
植物原生质体融合技术
融合
B. 高Ca2+和高pH值融合
• Ca2+浓度 0.05 mol/L • pH 9.5-10.5
具体做法(以烟草为例)
• 取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:1的 比例混合;
• 加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇; • 再用甘氨酸钠缓冲pH值到10.5，成为融合液，
FDA
荧光素
活细胞
活细胞 死细胞
死细胞
原生质体分离纯化流程图
第16章 植物原生质体融合技术 Plant Protoplast Fusion
• 植物原生质体的制备 • 植物原生质体的培养 • 植物原生质体的融合
二、植物原生质体的培养
1、原生质体的培养方法 2、原生质体培养程序 3、原生质体培养成功的技术关键
第16章 植物原生质体融合技术 Plant Protoplast Fusion
◆ Wh
植物细胞模式图
高尔基体
液泡
微丝
叶绿体 线粒体
质膜
细胞核 内质网 微管 细胞壁
细胞壁由三种主要成分构成 纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5%
◆ What 基本原理
4、原生质体的纯化
• 去除破碎的原生质体、末去壁的细胞、细 胞器及其他碎片等杂质
A、过滤法 B、漂浮法 C、离心法
例: 烟草叶肉细胞原生质体的 分离
1). 材料的准备与消毒： 2). 酶解： 3). 纯化： 4). 原生质体的活力测定
1). 材料的准备与消毒
选取在温室中生长两个月左右的烟草植株 从生长健康的植株上摘取充分展开的嫩叶片 经自来水冲洗干净后 放入70%乙醇中进行表面消毒 然后再放入2%次氯酸钠溶液中处理10分钟 接着用无菌水洗涤3～4次，以充分除去消毒剂
16 植物原生质体融合技术
4、选择杂种的方法
应用遗传或生理互补的选择方法能够在愈 伤组织水平或再生植株中有效地选择杂种，但 应考虑到杂种细胞生长发育过程中染色体的丢 失，因此，进行杂种选择时要小心谨慎。
5、由杂种细胞诱导获得再生植株是否 杂种的鉴定方法
· 形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。
· 细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。 · 生化鉴定：同功酶鉴定。 · 分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。
体细胞杂种的应用潜力
1、 植物育种中的核质替换 2、 细胞质杂种的获得 3、 远缘杂交创造新物种 4、 细胞器的互作研究
体细胞杂交研究的发展趋势
1、 诱导融合及杂种细胞的各种生理、生
化、遗传机理的研究
2、 电融合的程序化控制研究
3、 各种类型原生质体（胞质体、核质体、
细胞器）的制备技术研究 4、 杂种细胞培养技术的程序化研究
2、原生质体的制备
体细胞融合一般要求新鲜、制备时间
较短的原生质体，因分离时间过长，原 生质体开始长壁，影响融合效果。
3、融合方法
经改良的电融合法要优于PEG法，而且操作简 便，对细胞无毒害作用（Bates and Hazenkampt, 1985），诱导频率较高。但由于 电融合需要昂贵的电融合仪，这种方法现在应 用并不普遍。 PEG法操作比较复杂，融合效果受原生质体的 生理状态、纯度、密度和PEG的质量和浓度、 处理时间、钙离子浓度、洗液成分以及诱导融 合程序等因素影响较大，在融合时应加以考虑。
16 植物原生质体融合技术
体细胞杂交
（二）体细胞杂交的类型
根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合 可分为两大类： · 对称融合（asymmetric fusion）——即两个 完整的细胞原生质体融合。 · 非对称融合（symmetric fusion）——利用物 理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后 再进行融合。
原生质体细胞融合技术
食品生物技术课程论文原生质体细胞融合技术原生质体细胞融合技术摘要：细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术己在农业、医药、环保等领域得到了迅速发展和应用。
综述了细胞融合技术中的常用方法:细胞融合仙台病毒诱导法、细胞融合PEG（聚乙二醇)诱导法、细胞融合电场诱导法、细胞融合激光诱导法;以及最新研究进展:基于微流控芯片的细胞融合技术、高通量细胞融合芯片、空间细胞融合技术、离子束细胞融合技术、非对称细胞融合技术等，并对它们的优缺进行简要的评述。
关键词：原生质体细胞融合技术影响因素融合方法发展正文：原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交，是指细胞通过介导和培养，在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程。
利用现代科学技术，把来自于不同种生物的单个细胞融合成一个细胞，这个新细胞得到了来自两个细胞的遗传物质，具有新的遗传或生物特性。
原生质体融合技术起源于20世纪60年代。
1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。
1974年匈牙利的Ferenczy 等采用离心力诱导的方法，报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合，从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术，并从微生物种内融合扩展到界间的融合。
目前，通过原生质体融合进行体细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。
细胞融合核技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理念领域的研究提供了有力的手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方而都有广泛的应用价值。
特别是在单克隆抗体的制备、哺乳动物的克隆以及抗癌疫苗的研发等技术中细胞融合技术已成为关键技术。
1 原生质体融合技术微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备，原生质体融合，原生质体再生。
1. 1 原生质体制备与再生过程中的影响因素制备原生质体的最大障碍就是细胞壁，现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法，使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶，具体根据所用微生物的种类而定。
原生质体融合方法
原生质体融合方法原生质体融合是一种生物学实验方法，可以将两个不同类型的细胞或细胞器合并起来，形成一个新的细胞或多核细胞。
这项技术可以用于研究细胞信号传递、基因转移、蛋白质合成等生物学问题。
以下是关于原生质体融合的十条方法和详细说明。
1. 电融合法电融合法是原生质体融合中最常用的方法之一。
将两种不同的细胞分别制备成原生质体。
然后，将这两种原生质体放置于一对电极间，施加持续的电场脉冲，让细胞膜间形成暂时的孔道，从而使得两种原生质体间发生融合。
2. 化学融合法化学融合法也是一种常用的原生质体融合方法。
在这种方法中，使用一种特殊的化学物质如聚乙二醇，可直接将两种原生质体融合在一起。
在一些体系中，较低的离子浓度和温度也可以用于化学融合。
3. 热融合法热融合法是一种较为简单的原生质体融合方法。
在这种方法中，将两种原生质体放在高温环境中，以导致两种原生质体相互融合。
虽然方向较为简单，但是因为需要制备的原生质体较为容易受到热的影响，热融合法在实践中使用较少。
4. 脂质体介导法脂质体介导法是一种常用于外源基因转染的方法，但它也可以用于原生质体融合。
在这种方法中，先将两种原生质体分别与脂质体复合物混合，所形成的复合物直接融合。
5. 超声波融合法超声波法是一种比较新型的原生质体融合方法，在实验室中使用较少。
在这种方法中，使用超声波强制使分散在水相中的两种原生质体形成一个大型复合体，从而促进原生质体相互融合，形成一个新的细胞或原生质体。
6. 光融合法光融合法与其他融合方法不同之处是，它需要在特殊的光照条件下进行。
在这种融合方法中，两种原生质体分别注射不同颜色的发光蛋白，并在适当的光照条件下进行融合。
7. 激光融合法与前面介绍的融合方法不同，激光融合法使用的不是电场或化学物质，而是激光，它通过较强的能量促进原生质体的融合。
这种方法需要高度的技术要求，因此使用较为少见。
8. 微型流体融合法微型流体融合法是一种在生物芯片中使用的微型融合方法。
原生质体融合进技术与基因改组技术
（3）温度 ，并作为首轮多亲株融合的直接亲株。
诱变育种的具体操作要根据不同菌种的特性而异。 基因组改组技术是建立在原生质体融合技术基础之上的一种菌种选育新技术，首先选择一个原始亲株，通过经典的诱变育种方法获得
融合后的原生质体在加稳定剂的再生培养基上能重 新形成细胞壁，恢复正常的细胞形态，并能生长繁 殖，形成菌落。
影响原生质体再生的因素 （1）菌种本身特性 （2）原生质体制备条件 （3）再生培养基成分 （4）再生培养条件
基因组改组技术
基因组改组技术是建立在原生质体融合技术基础 之上的一种菌种选育新技术，首先选择一个原始亲 株，通过经典的诱变育种方法获得合的直接亲株，然后进行 多亲株融合，使其全基因组进行随机重组，获得第 一代融合株；再从中选择表型获得进一步提高的菌 株作为下一轮融合的直接亲本，依此类推进行多轮 的多亲株融合，最终从获得的突变体库中筛选出性 状被提升的目的菌株
Genome shuffling 技术的具体方法
从基因组改组技术的原理来看，进行基因组改组， 首先要运用诱变育种的方法，以获得目的性状得到 改进的正向突变菌株的基因组库，并作为首轮多亲 株融合的直接亲株。诱变育种的具体操作要根据不 同菌种的特性而异。然后进行多亲株的递推式融合 （recursive fusion） 。
（4）亲株的亲缘关系的直接亲株，然后进行多亲株融合，使
其全基因组进行随机重组，获得第一代融合株；
（5）原生质体的活性 影响原生质体制备的因素
影响原生质体制备的因素 融合后的原生质体在加稳定剂的再生培养基上能重新形成细胞壁，恢复正常的细胞形态，并能生长繁殖，形成菌落。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
－ 4－
中国科学院青岛生物能源与过程研究所
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology
原生质体研究的发展
1838 1873 1896 1931 1954 1958 1970 1972 1972 1974 1976 1976 1977 1978 1981 1988 2002 Muller Lugmbuthl Unna Wathin Bnders et al Marston Power et al Carlson Ferenczy et al Michayluk Ferenczy et al Fodor et al Hopwood Gleba et al Menczel Kirimalra et al Stemmer et al 动物病理组织中发现多核细胞 天花病脓胞周围发现多核细胞 水痘侵害过的皮肤中发现多核细胞 麻疹病人扁桃腺中发现多核细胞 组织培养中发现麻疹病毒能诱导细胞用和成多核体 用副流感病毒诱发细胞融合 探索用硝酸钠诱导植物原生质体融合 用NaNO3进行了烟草种间原生质体融合 以白地霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 发现PEG是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 发现 以曲霉 青霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 巨大芽孢杆菌内株间原生质体融合成功 链霉菌原生质融合并获融合重组子 用PEG+高pH-Ca2+研究原生质体融合 高 用高pH-Ca2++9℅DMSO与少量 与少量PEG获得较高的融合率 用高 与少量 获得较高的融合率 原生质体PEG融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 原生质体 一种新的体内分子育种方法——全基因组改组技术 全基因组改组技术 一种新的体内分子育种方法
内容
• 原生质体融合技术及应用发展介绍 • 原生质体融合的具体操作方法
－ 2－
中国科学院青岛生物能源与过程研究所
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology
原生质体融合
• 定义：指用自然或 指用自然或 人工方法、使两个 或更多个不同的细 胞融合成一个细胞 的过程，又称为体 细胞杂交
原生质体的制备 微生物种类不同其细胞壁结构和化学组成 不同，酶解处理的有效酶也不一样，因此 要根据微生物种类特性选择合适的酶。
细菌细胞壁的结构 G+ 糖肽、底聚糖、多糖、蛋白质、磷壁酸、糖醛酸、磷壁酸、脂多糖 G- 糖肽、磷壁酸、蛋白质、类脂、脂多糖、脂蛋白 放线菌的细胞壁 二氨基庚二酸、甘氨酸、阿拉伯糖、半乳糖 真菌的细胞壁成分 纤维素、几丁质、其它多糖
王玉华 John R P
2 2
梁惠仪 朱惠
徐波 Hida H
先诱变再改组，获得耐高温 王灏 (35℃)及耐乙醇的菌株(提高5%， 12.93%vol) 酶活提高3.17倍 平均酶活高于原始菌株 产量最高为516.37ug/L，较亲本 提高了44.72% 仅一年时间获得高产菌株，传统 方法需20年 pH3.8下生长良好，产酸比野生 型提高3倍 对剧毒杀虫剂五氯苯酚的耐受浓 度提高了10倍以上，并可降解 3mmol/L五氯苯酚 产羟基柠檬酸水平提高到145 mg/L 林俊 李立风 赵凯 Hiroyuki Patnaik Dai
哈 茨 木 霉 (Trichoderma 经 紫外 诱变得 到具有 MBC 得到同时具有MBC和戊唑醇 Lorant harzianum) 和 深 绿 木 霉 抗性及戊唑醇抗性菌株， 抗性的融合菌株 (T.atroviride) 进行融合 豌 豆 根 瘤 菌 (Rhrhizbium 豌豆根瘤菌具有penr 抗性，融合菌株具有双亲抗性， 韦革宏 leguminosorum) 和 大 豆 根 瘤 大豆根瘤菌具有cmr抗性 且能在双亲寄主植物上结 菌 (Sinorhizobium 瘤 xinjiangesis) 糖化酵母(S.diastaticus)和 单亲灭活 酿酒酵母(S.cerevisiae) 获得利用可溶性淀粉发酵 张华山 的融合菌株，利用率达 64.3%，在含5%淀粉发酵中 酒度可达6.5%(v/v) 产生能直接利用淀粉产乳 John R P 酸，产量40g/L，淀粉转化 率96%
白腐真菌(Phanerochaete)和 白腐真菌能有效降解木质 融合子可将木质素有109降 Zhang 白 地 霉 (Geotrichum 素，白地霉可生成单蛋白 到54g/kg，使得秸秆中蛋 candidium) 质 白质由48提高到67g/kg 酿酒酵母(S. cerevisiae) 经紫外诱变得到能于43℃ 选育出能耐受55℃高温的 Shi 生长的两突变株进行融合 融合菌株
原生质体融合技术的方法
原生质体融合育种一般包括如下步骤： ①标记菌株的筛选； ②原生质体的制备； ③原生质体的再生； ④原生质体的融合； ⑤融合子的选择； ⑥实用性菌株的筛选。
－10－ 10－
中国科学院青岛生物能源与过程研究所
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology
－11－ 11－
中国科学院青岛生物能源与过程研究所
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology
降解细胞壁所用酶类： 降解细胞壁所用酶类：
处理细菌细胞壁用酶： 处理细菌细胞壁用酶：溶菌酶Lysozyme 处理放线菌细胞壁用酶： 处理放线菌细胞壁用酶：Lytic Enzyme裂解酶、Lysozyme 溶菌酶 处理真菌用酶：纤维素酶Cellulase、酵母裂解酶 处理真菌用酶： Zymolyase、β-1,3葡聚糖酶、几丁质酶Chitinase、 Novozyme234(来自Trichoderma harzianum)、 Lywallzyme(广东微生物研究所溶壁酶) 、Glucuronidase 葡聚糖苷酸酶 (for yeast)、蜗牛酶snailase
碱性脂肪酶产生菌扩展青霉 (Penicillium expansum) 曲霉BI 紫杉醇产生菌多节孢属 (Nodulisporium sylviforme) 产泰勒菌素的弗氏链霉菌 (Streptomyces fradiae) 乳杆菌 Sphingobilum chlorophenolicum 羟基柠檬酸生产菌Streptomyces sp. 核黄素生产菌Bacillus subtilis 柔红霉素生产菌 抗生素产生菌比基尼链霉菌 (Streptomyces bikiniensis)
中国科学院青岛生物能源与过程研究所
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology
原生质体融合技术及方法简介
－ 1－
中国科学院青岛生物能源与过程研究所
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology
提高代谢产物的产量和质量 提高菌株降解能力 提高菌株抗受性 改良菌种的遗传特性 获得新代谢途径和性状
－ 6－
中国科学院青岛生物能源与过程研究所
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology 融合亲本菌株 产普纳霉素始旋链霉菌 （ S ． pristinaespiralis ） CGMCC0957突变菌 多杀菌素产生菌 Saccharopolyspora spinosa 黑 曲 niger) 霉 融合子 融合结果 4株突变产量较高菌株融 得到普纳霉素产量比亲本 合 高89.4%，达到0.89g/L的 优良菌株 10株产量较高的菌株进行 多 杀 菌 素 产 量 可 达 到 融合 547mg/L ， 较 出 发 菌 提 高 200.55% (Aspergillus 经 紫外 或EMS 诱变， 筛选 葡萄糖氧化酶产量最高为 胞外葡萄糖氧化酶活性最 62.7u/ml，较亲本提高了 394.3% 高菌株进行融合 对铬有较高抗性和除铬性 能较高的两种酵母进行融 合 作者 Xu
德氏乳酸杆菌突变株和淀粉 基因组三轮改组 酶 产 生 菌 (Bacillus amyloliquefaciens)
－ 7－
中国科学院青岛生物能源与过程研究所
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology
基因组重排技术
20世纪90年代，美国加州Maxgen公司在原生质体融合技术的基础上提出了基因 组重排技术（genome shuffling）技术的概念，基因组重排技术是经典微生物诱变育种 技术与原生质体融合技术的有机结合。首先对微生物菌体进行诱变，筛选出正向突变 菌株，然后通过原生质体“递推式融合”使正向突变的若干个菌株进行原生质体融合， 筛选出符合育种要求的融合子，从而在短时间内获得性状得到大幅度提高的菌株。由 于此技术在无需了解微生物遗传性状的条件下即能实现微生物的定向育种，获得正向 突变的菌株，自此技术诞生以来，短短几年时间里在工业生产菌种改进及开发方面就 获得了成功的应用。
－ 5－
中国科学院青岛生物能源与过程研究所
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology
原生质体融合的优势
打破了微生物的种界 界限，可实现远缘菌株 的基因重组。可使遗传 物质传递更为完整、获 得更多基因重组的机会。 可与其他育种方法相结 合，如把常规诱变和原 生质体诱变所获得的优 良性状，组合到一个单 株中。
－ 8－
中国科学院青岛生物能源与过程研究所
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology 改组菌种 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) 干酪乳酸菌(Lactobacillus casei) 德氏乳酸杆菌突变株和淀粉酶产 生菌(Bacillus amyloliquefaciens) 产纤溶酶的枯草芽孢杆菌 纳他霉素产生菌褐黄孢链霉菌 (Streptomyces gilvosporeus) 替考拉宁产生菌SIIA 01-11-25 异亚硝基酸产生菌 (Streptomyces sp.) 3株酿酒酵母菌 2 3 改组次数 2 改组结果 15%葡萄糖36h发酵产乳酸 135.6g/L，提高葡萄糖耐受性及 产酸能力 产酸能力提高2.4倍，提高耐酸 性 产生能直接利用淀粉产乳酸，产 量40g/L，淀粉转化率96% 酶活1600U/ml以上，较亲本提高 4-5倍 产量提高到3574mg/L，较亲本提 高1.5倍 产量提高65.3% HCA产量最好194mg/L，是野生型 的5-6倍 作者 于雷