羊痘病毒及其疫苗研究进展

羊痘病毒及其疫苗研究进展
赵志荀;吴国华;颜新敏;张强
【摘要】国内外已对羊痘病毒及对羊痘的预防控制做了大量的研究工作.羊痘病毒的流行病学特征、分离及体外培养、体外检测已有了较快的发展,而其致病机制和
基因组结构、分子表位、结构蛋白及非结构蛋白等分子生物学特征的研究尚待逐渐进入更加深入的研究.近年来的研究主要是针对结构基因如p32的各类载体的构建、表达和对非结构基因如TK基因的研究及其缺失载体的构建、IRT的功能研究等等.全面而深入的分子生物学和免疫学基础的研究,将为发展更为有效的检测诊断方法,
并为安全有效的亚单位疫苗、重组疫苗及核酸疫苗的研制奠定基础.
【期刊名称】《动物医学进展》
【年(卷),期】2010(031)004
【总页数】5页(P77-81)
【关键词】羊痘病毒;毒力相关基因及蛋白;ITR基因及分子诊断;疫苗
【作者】赵志荀;吴国华;颜新敏;张强
【作者单位】中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验
室农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃兰州 730046;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州,730070;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点
实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃兰州 730046;中国农业科学院兰州
兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃兰州 730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃兰州 730046
【正文语种】中文
【中图分类】S852.654
羊痘病毒(Capripox virus,CPV)是最重要的动物痘病毒,在分类地位上属于痘病毒科(Poxviridae)脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxrinae)中的羊痘病毒属(Capripoxvirus)成员,包括山羊痘病毒(Goat pox virus,GPV)、绵羊痘病毒(Sheep pox virus,SPV)和牛结节疹病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)[1]。

作为山羊痘、绵羊痘和牛结节疹病的致病因子,CPV能引起这些动物最为严重的疾病[2]。

在非洲、中东、中亚以及印度,SPV、GPV对小反刍兽产生了极大影响,在这个些地方它们的流行常常导致易感动物很高的发病率和死亡率[3-4]。

而相反,LSDV限于非洲大陆和马达加斯加存在,而且牛的结节性疹块病发病率不定,死亡率低[5]。

最近几十年,科研人员对CPV进行了大量研究,许多实验室都做了大量工作,试图通过一步步深入的研究,能够控制、消灭羊痘。

随着CPV基因组的公布,几年的时间内,大量文献报道了CPV研究情况。

文章就CPV的分子生物学以及其相关疫苗的研究进展做一综述。

1 病毒基本特征
CPV为卵圆形或砖形病毒,胞浆内复制,其基因组是双链DNA,其大小约为290
nm×270 nm。

CPV由1个核、2个侧体和2层脂质外膜组成,属于较小的痘病毒病毒粒子。

CPV的衣壳有囊膜,囊膜内含有病毒特异性蛋白。

核是由DNA和蛋白质组成的核蛋白复合体,位于病毒粒子的中央,呈两面凹陷,凹陷内分布有2个侧体。

核和侧体一起由脂蛋白性表面膜包围,其间充填有可溶性蛋白,一层栅栏状的核心膜紧贴于核心周围。

CPV对干燥有较强的抵抗力,在干燥的痂皮内可存活3个月～6个月,在干燥羊舍内
可存活6个月～8个月[6]。

反复冻融对其没有明显的灭活作用,但对直射阳光、常
用消毒药以及乙醚或氯仿敏感,放线菌素-D和溴脂氧尿苷可抑制病毒复制。

CPV可在牛、绵羊、山羊源的组织培养细胞上生长,原代、次代羔羊睾丸细胞和肾细胞最
为敏感[7],也可用Vero细胞等细胞系对CPV进行培养。

CPV接种细胞后最早可在感染后4 d使少量细胞出现细胞病变,之后的4 d～6 d细胞病变迅速扩展到整个细胞层。

观察是否有CPE出现最多可达14 d。

2 CPV的基因组结构
CPV基因组较大,由143 kb～147 kb碱基组成,A+T含量约为75%。

CPV含有147个开放阅读框(opening read frame,ORF),编码密度约为93%,能够编码53个～2 027个氨基酸。

CPV的基因组由中间编码区和两端相同的反向末端重复序
列(inverted terminal repeat,ITR)构成。

中间编码区[(ORFs024～123)]是一个与痘苗病毒(Vaccinea virus,VV)基因的所有
保守基因同源的核心编码区域,其左侧和右侧的10～27 kb的基因结构中包含有重要的编码功能的基因序列,含有基因编码病毒复制的必需因子其参与病毒转录、RNA修正、病毒DNA复制、病毒粒子的构建和装配等。

两端IT R(ORFs001～023,ORFs124～156)长度均约为2.3 kb,保守性较低,但含有一些功能基因家族,与病毒感染的宿主范围、毒力等特性有关。

这些基因家族包含
5个ankyrin基因重复序列和3个kelch基因重复序列,还有一些细胞因子结合蛋白、IL-10、表皮生长因子样蛋白、PKP抑制因子、丝氨酸蛋白酶抑制剂、痘病毒
特异性毒力基因等的同源序列,它们编码的蛋白质与病毒的修饰、病毒在宿主细胞
中的逃逸、细胞凋亡以及免疫应答等有关[8-9]。

IT R最末端是两条链交叉连接的
发卡环,紧接着是由两套独特序列隔开的串联重复序列。

SPPV的ITR上的串联重复序列大小为46 bp,LSDV的为5 bp,而在GTPV的IT R上则不存在串联重复序列。

3 CPV毒力相关基因及蛋白研究概况
3.1 P32基因及其编码蛋白
3.1.1 p32基因 p32基因位于CPV基因组的64～65 kbp处,由第74号 ORF编码,是CPV 基因组的长3.7 kbp HindⅢ、PstⅠ片段的一部分。

HindⅢ、PstⅠ片段含有5个ORF,分别与VV的J6R、H1L、H2L、H3L、H4L 基因同源,即P32基因与编码位于胞内成熟VV病毒粒子表面的p35蛋白的基因具有同源性。

SPPV、GTPV的 p32基因的阅读框分别由323、322个氨基酸组成,分别由972 bp、969 bp的碱基编码。

它们在基因组成上高度保守,在核苷酸水平和氨基酸水平上分别有97.5%和9
4.7%的同源性[10]。

两者P32基因最主要的区别是在SPPV的P32序列中的55位处是天冬氨酸,而在GTPV和LSDV中不存在。

GTPV 和SPPV的p32基因有两个EcoRV酶切位点,而在LSDV中则没有EcoRV酶切位点的存在。

3.1.2 结构蛋白p32 p32蛋白是从CPV感染细胞中分离得到的结构蛋白,分子质量为32 ku。

此蛋白为CPV的各毒株所共有且含有重要的抗原决定簇,它能够刺激豚鼠迅速产生抗CPV的中和抗体。

p32蛋白是CPV的囊膜蛋白,由319个～324个氨基酸组成,具有跨膜的螺旋结构,该结构位于C端287位～307位氨基酸处。

现已证实p32蛋白是羊痘病毒属特有的蛋白,存在于所有已分离的CPV毒株中,其单一血清可以中和CPV感染早期产生的抗体。

因此P32基因可作为羊痘PCR诊断的目的基因。

3.1.3 P32基因克隆、表达及应用 p32蛋白是目前世界各地分离、鉴定的CPV共有且特异很强的结构蛋白。

获得可溶性的p32蛋白是进行CPV抗体检测以及进行亚单位疫苗研制的前提条件。

因此到目前为止,基于p32结构蛋白进行的克隆、表达已相当多。

国内外研究人员已构建了各种各样的连接载体和表达载体,也取得了不同程度的成果。

早在1994年,Chand P等[11]利用大肠埃希菌表达了谷胱甘肽S转移酶融合和多
聚组氨酸融合的重组p32蛋白,并以该重组蛋白作为抗原建立间接ELISA方法,而且证明了重组蛋白与正痘病毒和副痘病毒阳性血清均没有反应。

全长p32蛋白可溶性最大,且在ELISA中的反应性最好。

近年来,国内不少研究人员扩增了P32基因,克隆至不同载体,并分别在原核和真核细胞中表达了有一定活性的目的蛋白。

但由于p32蛋白的跨膜区对细胞具有毒性作用,使其表达量低,很难纯化到重组p32蛋白[12]。

于是,国内外研究者便以截去跨膜区的P32基因为研究对象,研究其重组蛋白的用途。

Chand P等[11]曾用截去跨膜区的重组p32蛋白为抗原,研究了检测抗体的间接ELISA方法,该法快速、可靠,且没有传染性。

但是最近的研究结果表明,全长p32蛋白截去跨膜区后,对其免疫原性有一定的影响[13]。

3.2 非结构基因及相关基因
3.2.1 TK基因的研究多种DNA病毒具有胸腺嘧啶核苷激酶基因(TK基因)编码的胸腺嘧啶核苷激酶。

CPV的TK基因位于基因组中部ORF66处,距离两端的ITR分别为52 kb和91 kb。

TK基因编码174个氨基酸的多肽,这些多肽与 VV的J2R 基因编码多肽的同源性约66%。

在痘病毒科中不同属的痘病毒 TK基因的位置不同[14],在CPV、VV、鸡痘病毒(Fowl pox virus,FPV)中 TK基因分别位于基因组的3个不同的位置。

Amano H等[15]猜测,这种位置的不固定性很可能是在痘病毒进化过程中,由于痘病毒的基因组重排造成的。

尽管存在位置不固定,但TK基因均位于基因组的中间区域而且具有较高的保守性。

CPV拥有庞大的基因组和许多非必需区,具有研究基因缺失疫苗和病毒活载体的巨大潜力。

TK基因是CPV的主要毒力基因,也是病毒复制的非必需基因,缺失T K基因的CPV突变株在细胞中的复制能力极大减弱,因而使疫苗更安全。

目前国内外已有不少关于TK基因重组病毒的构建。

Bhanuprakash V等[16]利用TK基因作为非必需区构建了重组CPV。

郭巍等[17]克隆了我国山羊痘弱毒疫苗(GT PV-TY)的 TK基因,并利用同源重组构建了带有同源重组臂和筛选标记的转移
载体。

郑敏[18]通过试验研究获得一株性状稳定并保持形态、生长性能和免疫原性不变,但对山羊致病力降低的TK基因缺陷毒株;其整个试验结果还证实了GTPV的serpin蛋白可通过抑制caspase-8活性而抑制细胞凋亡。

不过,目前GTPV缺失疫苗和活载体的研究依然处于起步阶段。

但是上述研究无疑也将会对活载体缺失疫苗的研制进一步奠定基础。

3.2.2 ITR基因及其在CPV分子诊断中的应用
目前,国内应用PCR方法检测CPV主要是针对p32蛋白基因,但是针对p32蛋白基因检测往往也存在不足,而对于同一样本针对ITR基因片段进行扩增,能够较容易的检测出病毒的存在。

因此,有人便基于ITR基因片段进行研究,试图另外找到可应用PCR方法检测的更为保守、敏感的CPV的基因片段。

Mangana V O等[19]用CPV的KS-1株和InS-1株的IT R为为目的基因设计引物建立了鉴别SSPV的简单、快速、特异的PCR方法,能将SPPV与GTPV和疱疹病毒(Herpesviruses)区分开;Markoulatos P等[20]用IT R和α微管蛋白为目的基因设计引物,建立了检测皮肤组织中的SPPV和羊传染性脓疱病毒(Contagious ecthyma virus,CEV)的多重PCR技术,该技术采用3对引物、一步扩增方法,比用单一引物的PCR方法更快、更敏感。

徐春志等[21]和王开功等[22]分别应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y、B-株反向ITR 片段,并将其克隆至 pMD18-T载体,构建了重组质粒pMD18-ITR,再将该重组质粒转化DH5α感受态细胞进行培养,对通过PCR、酶切鉴定为阳性的重组菌进行序列测定。

徐春志等将所得序列与Gen-Bank收录的2株山羊病毒、3株绵羊痘病毒全基因序列进行比较分析。

结果所测 4个毒株序列与GenBank上收录的GTPV的该片段核苷酸序列的同源性均100%,与SSPV的该片段核苷酸序列的同源性均为98.3%。

王开功等研究也表明,4株病毒都可得到一条长度均为289 bp 的DNA片段,该片段可被内切酶AluⅠ特异识别,而且该PCR的DNA模板最小检
出量为24.40pg。

与此同时,罗阿东等[23]根据CPV的 ITR的核苷酸序列设计引物,以CPV的DNA
为模板,建立并优化了SYBR Green I模式荧光PCR检测GPV的ITR基因的方法,
并与普通PCR方法进行敏感性比较。

结果表明,建立的检测 GPV的 SYBR Green I 荧光PCR方法能检测出7×102拷贝数的DNA模板比文献报道的普通PCR法更
敏感、准确、快速。

他们的研究结果均表明,ITR基因片段在羊痘病毒属中也很保守,可以针对IT R基因建立CPV的PCR检测方法。

4 CPV分子检测
目前国内基于CPV不同的基因建立了不同的分子检测方法,但是每个方法都不是完美的。

如建立在P32基因的PCR方法,以及最近Balamurugan V等[24]构建的荧光定量PCR方法均各自有不同的不足。

而尽管基于重组P32建立的ELISA方法具有高度的特异性且与正痘病毒和副痘病毒没有交叉反应,但由于全长P32表达量低,很难得以推广使用。

因此国内外不少研究人员[25-26]正研究CPV的其他特异性强、表达量高的功能基因,试图建立出CPV的诊断检测的新途径。

5 疫苗研制
5.1 CPV传统疫苗
国内外科研人员通过广泛使用许多CPV毒株作为活疫苗,成功制备了二十多种灭活或弱毒疫苗。

有的免疫后保护力可长达1年以上,有的甚至终生免疫。

我国使用的
疫苗主要是1958年沈荣显等将分离得到的GTPV太原株经过鸡胚化致弱而制成的弱毒疫苗,其免疫期可达1年。

而灭活苗往往只能提供暂时性的保护,因为以组织培养细胞制备的灭活疫苗的病毒粒子不具备完整囊膜,接种动物后不能有效刺激机体
产生对带有完整囊膜的病毒粒子的免疫力。

而且灭活疫苗通常不能有效激活细胞免疫,而CPV的免疫反应则主要是细胞免疫。

所以灭活苗的效果常常不是很好。

而且
活疫苗在非疫区使用时存在有病毒扩散的可能,所以尚需科研人员对CPV疫苗做进一步研究,期望在深入了解CPV的毒性和宿主范围的基因基础上,能够增加疫苗设计的有效性和多功能性。

5.2 CPV亚单位疫苗
p32蛋白是目前世界各地分离、鉴定的所有CPV共有且特异很强的结构蛋白,但是要获得基于p32的CPV亚单位疫苗,必须先得到可溶性的p32蛋白。

Carn V M
等[27]曾研究了大肠埃希菌表达的GST融合重组p32蛋白混合弗氏佐剂对试验山羊进行肌肉注射接种,并对重组蛋白的保护性进行了研究。

试验结果证明将GST
p32配以佐剂接种山羊可以提高病毒中和抗体水平,降低CPV强毒感染引起的临床症状。

虽然不能阻止病毒在攻毒部位的复制,但是可以阻止病毒向周围的扩散,并且
使动物对病毒的反应更加敏感。

但是在由于p32蛋白在表达的过程中会出现表达量低、表达不稳定等问题,这就在一定程度上制约着p32蛋白开发成亚单位疫苗的应用前景。

因此在CPV中寻找到免疫原性更好、表达量更大、表达更稳定的基因是十分重要的。

5.3 CPV基因缺失疫苗
CPV的宿主范围专一,仅感染山羊、绵羊和牛这类反刍动物,因此更具有用作载体研制活载体疫苗的优势。

使用基因工程技术去除CPV的毒力相关的特定基因或基因
片段可进一步获得的缺失疫苗。

目前大多数研究者都试图通过缺失TK基因来实现。

如王芳等[28]构建TK基因缺失重组病毒以为获得能区分自然感染和疫苗免疫的基因工程标记疫苗,郭巍等将LacZ基因表达盒插入TK基因缺失转移载体筛选了TK
基因缺失的GTP-VTY突变株。

但是截至目前仍没有正式使用CPV缺失疫苗进行
免疫预防CPV的报道。

随着分子生物学的发展,人们对CPV的认识逐渐深入。

在基因组结构与功能、基因定位和基因表达调控等方面的研究不断取得进展,这也将对研发更为有效安全的基
因工程疫苗奠定基础。

6 结论
随着分子生物学迅速发展,目前对CPV的研究已经逐渐更为全面而深入。

在以p32蛋白为研究热点以外,展开对CPV其他特异性强、表达量高的基因的深入研究[25-26,29-30],将为更进一步解析病毒的功能提供依据。

CPV毒力相关基因和决定宿主范围的基因的鉴定以及其特性的研究,将会为全面理解宿主与病原之间的相互作用,为获得新的更有效更特异检测诊断方法以及重组疫苗的研制提供新的途径。

而对羊痘病毒更多复制非必需片段的筛选及更为有效的CPV载体的构建,也必将为反刍兽的传染病和其他动物疾病的控制产生深远的影响。

参考文献:
[1]Diallo A,Viljoen G J,Mercer A A,et al.Genus Poxviruses
capripoxvirus[M].Birkhauser,Basel,2007:167-181.
[2]Damon I K,Knipe D M,Howley P M,et al.Fieds virology[M].Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,2007:2947-2975.
[3]Babiuk S,Bowden T R,Boyle D B,et al.Capripox virus:an emerging worldwide threat to sheep,goat and cattle[J].T ransbound Wmerg
Dis,2008,55:263-272.
[4]Kitching R P,Carn V M,Sheep pox and goat pox.Office International des Epizooties,Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals(mammals,birds and bees)[M].OIE:Paris,2008:1282-1286.
[5]Kitching R P,Carn V M.Lumpy skin disease.Office International des Epizooties,M anual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals(mammals,birds and bees)[M].OIE:Paris,2008:768-778.
[6]Timothy R B,Shawn L B,Geoff R P,et al.Capripoxvirus tissue tropism and
shedding:A quantitative study in experimentally infected sheep and goats[J].Virology,2008(371):380-393.
[7]Shawn B,Geoff P,John C,et al.Evaluation of an ovine testis cell line(OA3.T s)for propagation of capripoxvirus isolates and development of an immunostaining technique for viral plaque visualization[J].Vet Diagn Invest,2007,19:486-491.
[8]Balinsky C A,Delhon G,Afonso C L,et al.Sheep pox virus Kelch-like gene SPPV-019 affects virus virulence[J].J Virol,2007,(81)20:11392-11401. [9]Christian L G,Charles E L,Emna F,et al.Capripoxvirus G-protein-coupled chemokine receptor,a host-range gene suitable for virus-animal origin discrimination[J].J Gen Virol,2009,90(8):1967-1977.
[10]Heine H G,Stevens M P,Foo rd A J,et al.A capripox virus detection PCR and antibody ELISA based on the majo r antigen P32,the homolog of the vaccinia virus H3L gene[J].Immunol Methods,1999,227(1-2):187-196. [11]Chand P,Kitching R P,Black D N,et al.Western blot analysis of virus-specific antibody responses to capripoxvirus and contagious pustular dermatitis infections in sheep[J].Epidemiol Infect,1994,113:377-385. [12]熊毅,朱伟,刘棋,等.山羊痘病毒P32基因跨膜区缺失载体的构建与表达[J].农业生物技术学报,2008,16(3):385-389.
[13]陈轶霞,才学鹏,景志忠,等.羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建、表达及其免疫原性[J].病毒学报,2008,24(2):133-137.
[14]王芳,陈洪岩,刘胜旺,等.山羊痘病毒疫苗株ORF64～O RF67的分子特征[J].中国预防兽医学报,2007,29(2):96-102.
[15]Amano H,Ueda Y,Miyamura T,et al.Identification and characterization
of the thymidine kinase gene of Yaba virus[J].J Gen Virol,1995,76(5):1109-1115.
[16]Bhanuprakash V,Indrani B K,Hosamani M,et al.The current status of sheep pox disease[J].Comp Immunol Microbial Infect Dis,2006,29(1):27-60.
[17]郭巍,曲娟娟,相文华,等.通用山羊痘病毒 TK基因缺失转移载体的构建[J].吉林农业大学学报,2008,30(5):739-742.
[18]郑敏.山羊痘病毒基因缺失毒株及DNA疫苗的构建、鉴定和实验免疫[D].吉林长春:吉林大学,2008.
[19]Mangana V O,Vougiouka O,Markoulatos P,et al.Sheep poxvirus identification by PCR in cell cultures[J].J Virol M ethods,1999,77:75-79. [20]Markoulatos P,Mangana V O,Koptopoulos G,et al.Detection of sheep poxvirus in skin biopsy samples by amultiplex polymerase chain reaction.[J].Virol Methods,2000,84(2):161-166.
[21]徐春志,周碧君,岳筠,等.山羊痘病毒反向末端重复序列的克隆与序列分析[J].畜牧与兽医,2007,39(07):11-13.
[22]王开功,岳筠,徐春志等.山羊痘病毒IT R基因片段的克隆与序列分析[J].中国预防兽医学报,2008,30(7):519-522.
[23]罗阿东,唐源,文明,等.山羊痘病毒SYBR Green荧光PCR检测方法的建立[J].山地农业生物学报,2008,27(6):503-507.
[24]Balamurugan V,Jayappa K D,Hosamani M,et parative efficacy of conventional and taqman polymerase chain reaction assays in the detection of capripoxviruses from clinical samples[J].J Vet Diagn Invest,2009,21(2):225-231.
[25]Bowden T R,Coupar B E,Babiuk S L,et al.Detection of antibodies specific
for sheeppox and goatpox viruses using recombinant capripoxvirus antigens in an indirect enzyme-linked immunosorbent assay[J].J Virol Method,2009,161(1):19-29.
[26]Babiuk S,Wallace D B,Smith S J,et al.Detection of antibodies against capripoxviruses using an inactivated sheeppox virus ELISA[J].Transbound Emerg Dis,2009,56(4):132-141.
[27]Carn V M,Kitching R P,Hammond J M,et e of a recombinant antigen in an indirect ELISA for detecting bovine antibody to capripoxvirus[J].Virol Methods,1994,49:285-294.
[28]王芳,刘胜旺,邵昱昊,等.山羊痘基因工程标记疫苗的初步研究[J].中国比较医学杂志,2007,17(8):S15.
[29]王晓霞,郑亚东,骆学农,等.绵羊痘病毒甘肃流行株糖蛋白基因ORF117的克隆及其原核表达[J].中国预防兽医学报,2009,31(5):337-341.
[30]陈轶霞,才学鹏,郑亚东,等.绵羊痘病毒甘肃流行株O RF121基因的克隆及序列分析[J].畜牧与兽医,2009,41(4):61-63.。