安妥沙星体外诱导大肠埃希菌耐药研究

安妥沙星体外诱导大肠埃希菌耐药研究
朱安祥1,朱瑞奇1,吴㊀韩1,曾杨梅2,吴俊伟1,2
(1.西南大学动物科学学院,重庆荣昌402460;2.重庆布尔动物药业有限公司,重庆荣昌402460)
㊀㊀摘要:为了探讨耐药外排泵AcrAB-TolC 在大肠埃希菌对安妥沙星的诱导耐药中的发生机制,试验采用微量肉汤稀释法测定安妥沙星对大肠埃希菌标准菌株(ATCC25922)的最小抑菌浓度(MIC),以1/2MIC 为起点采用浓度递增法对ATCC25922进行体外诱导,并将诱导后的细菌在不含药的培养基上传代培养5次,每次传代后测定MIC 值,以获得稳定耐药的菌株㊂并检测安妥沙星诱导前后大肠埃希菌株外排泵AcrAB-TolC 基因序列的突变和mRNA 表达量的变化㊂结果表明,
诱导后的耐药菌株acrA 有8处㊁acrB 有40处㊁tolC 有27处发生了碱基突变,其中acrB 和tolC 所编码的氨基酸序列也发生了改变,并且诱导后的菌株耐药外排泵AcrAB-TolC 的基因acrA ㊁acrB ㊁acrZ ㊁tolC 的mRNA 表达量极显著增加㊂
关键词:安妥沙星;大肠埃希菌;外排泵AcrAB-TolC
中图分类号:S852.61+2㊀㊀㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀㊀㊀文章编号:05296005(2019)12008805
㊀㊀
Study of Antofloxacin Induced in E.coli Resistance
ZHU An-xiang 1,ZHU Rui-qi 1,WU Han 1,ZENG Yang-mei 2,WU Jun-wei 1,2
(1.College of Science ,Southwest University ,Chongqing 402460,China ;2.Chongqing Bull Animal
Pharmaceutical Co.,Ltd.Chongqing 402460,China)
Abstract :In order to investigate the genetic characteristics of Antofloxacin-resistant ATCC25922induced by Antofloxacin in
vitro,one ATCC25922susceptible to Antofloxacin were induced by treatment with sub-MIC of Antofloxacin in vitro.In order to ob-
tain a stable and appropriate detection resistance strains,the induced bacteria in the medium without Antofloxacin subcultured five times,and MIC value of each passage was determined.Mutation and mRNA expression of AcrAB-TolC gene of Escherichia coli strain
was analyzed before and after induction.The results showed that after the induction of resistant strains,acrA 8,acrB 40,and tolC 27had nucleotide mutations,and the amino acid sequence of acrB and tolC was also changed.The mRNA expression of AcrAB-TolC ef-flux pump gene acrA,acrB,acrZ,tolC was significantly increased.
Key words :Antofloxacin ;Escherichia coli ;efflux pump AcrAB-TolC Corresponding author :WU Jun-wei ,E-mail:wjw999@
收稿日期:20181105
基金项目:重庆市基础科学与前沿技术研究项目(cstc2017j-cyjAX0040);国家自然科学基金资助项目(31372483)作者简介:朱安祥(1992-),男,硕士,研究方向为兽医药理学
与药物制剂,E-mail:zhuanxiangzax@
通讯作者:吴俊伟,E-mail:wjw999@
㊀㊀近年来,由于抗微生物药物的滥用,抗生素耐药性已成为本世纪公共卫生的主要威胁,兽医临床上的细菌耐药性问题也遍布全球[1]㊂交叉耐药㊁多重耐药等问题的出现为临床各类疾病的预防和治疗带来愈加严峻的挑战㊂安妥沙星是我国首个自主研发的喹诺酮类新药,2009年批准上市,具有良好的体内外抗菌能力和安全性,目前主要用于人医临床上大肠埃希菌引起的急性肾盂肾炎和膀胱炎,随着宠物在家庭中地位的提高,该药今后有望开发为宠物药品㊂大肠埃希菌多重耐药的产生主要与其外排泵系统有关,已有的试验数据㊁研究结果提
示,外排泵AcrAB-TolC 是导致其产生耐药最主要的药物外排泵[2]㊂
本试验用安妥沙星诱导大肠埃希菌标准菌株
ATCC25922,对诱导前后菌株进行最小抑菌浓度(MIC)测定,并通过对诱导前后菌株的外排泵Ac-rAB-TolC 调控基因acrA ㊁acrB ㊁tolC ㊁acrZ 的序列及mRNA 表达量进行分析,以期为该细菌在以AcrAB-TolC 为中心的外排系统介导的大肠埃希菌多重耐药㊁分子生物学等方面的研究提供参考㊂1㊀材料与方法
1.1㊀菌种㊀大肠埃希菌ATCC25922,购自中国兽医药品监察所㊂
1.2㊀主要试剂㊀安妥沙星,购自中国食品药品检定研究院;乳酸环丙沙星㊁恩诺沙星,购自上虞京新药业有限公司;盐酸土霉素,购自河北建民淀粉糖业
有限公司;硫酸黏菌素,购自河北圣雪大成唐山制药有限责任公司;硫酸庆大霉素,购自烟台只楚药业有限公司;磺胺嘧啶,购自西南合成制药股份有限公司;LB肉汤培养基㊁LB琼脂培养基㊁MH肉汤培养基㊁MH琼脂等培养基,均购自青岛高科园海博生物技术有限公司;Pfu PCR Master Mix(KP201),购自天根生化科技(北京)有限公司;琼脂糖㊁UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒,购自生工生物工程(上海)股份有限公司;GoScript TM Reverse Transcription System反转录试剂盒㊁TaKaRa SYBR Premix Ex Taq TM II(Tli RNase H Plus)定量试剂盒,购自普洛麦格生物技术有限公司㊂
1.3㊀测定最小抑菌浓度(MIC)
1.3.1㊀复苏标准菌株ATCC25922㊀将标准菌株ATCC25922从-80ħ冰箱取出,37ħ水浴3-4min,待菌株融化后,用微量移液器吸取5μL于LB肉汤中,置于37ħ培养18-24h,次日接种到LB琼脂平板上,置于37ħ培养18-24h,备用㊂1.3.2㊀微量肉汤稀释法测定MIC㊀按照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)提供的兽医版药敏试验标准(VET01-A4)[3],采用微量肉汤稀释法测定所有抗菌药对ATCC25922的最小抑菌浓度(MIC)㊂1.3.3㊀体外诱导大肠埃希菌㊀根据1.3.2测定的安妥沙星的MIC,参照张静等[4]的方法以1/2ˑMIC 浓度的安妥沙星为起点体外诱导标准菌株,获得耐药性稳定的菌株A㊂测定安妥沙星和其他药物对诱导前后细菌的MIC,方法同1.3.2㊂
1.4㊀诱导前后菌株外排泵AcrAB-TolC基因突变情况
1.4.1㊀引物设计㊀根据GenBank中大肠埃希菌相应基因序列设计PCR扩增引物,acrB由于序列较长,将其分为2段设计2对引物分别扩增,见表1,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成㊂以大肠埃希菌DNA为模板,进行PCR扩增,电泳检测后将产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序㊂
表1㊀目的基因PCR扩增引物
基因引物序列(5ᶄң3ᶄ)退火温度/ħ扩增片段/bp基因全长/bp
acrA F:TCGTAGGATATTGCGCCACC
R:TGTTCGTGAATTTACAGGCGTT60.71468㊀1194
acrB1 acrB2F:ACGCGGCCTTAGTGATTACA
R:AAAGGCTTCTTCGGCTGGTT
F:GTAGTGGTGCGTGCTCTTCT
R:AGTCTTAACTTAAACAGGAGCCGT
55㊀㊀㊀㊀㊀1651㊀㊀㊀㊀
54.6㊀㊀㊀㊀1611㊀㊀㊀㊀
3150㊀㊀
tolC F:GCCGTTTGAGCAGTCATGTG
R:AATGCGGCAGATAACCCGTA54.6㊀㊀㊀㊀1699㊀㊀㊀㊀1482㊀㊀
acrZ F:TAATGGAACCGGAAAGCGCA
R:ATATCGGCAGGAAAAGCAGGA54.6㊀㊀㊀㊀446㊀㊀㊀㊀150㊀
1.4.2㊀诱导前后细菌acrA㊁acrB㊁tolC和acrZ序列的变异情况㊀将细菌培养至生长对数期,以浓度约为3.0ˑ108CFU/mL的新鲜菌液为模板,用合成的引物利用PCR技术扩增相应基因,反应体系如表2所示㊂各基因的PCR反应程序:94ħ预变性3min, 94ħ变性30s,退火温度见表1,时间30s,72ħ延伸2min,共30个循环,最后72ħ温育5min㊂PCR 反应结束后,用1.5%的琼脂糖凝胶检测扩增产物,将符合要求的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序㊂
1.5㊀诱导前后细菌外排泵AcrAB-TolC基因的mRNA表达量的变化㊀根据GenBank中大肠埃希菌相应基因序列设计外排泵基因acrA㊁acrB㊁tolC㊁acrZ 荧光定量PCR扩增引物,以大肠埃希菌的看家基因gapA为内参,见表2,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成㊂提取细菌总RNA,并反转录成
cDNA㊂以cDNA为模板上机检测㊂反应条件: 95ħ30s,95ħ5s,61ħ35s,共40个循环,每次循环读板1次;熔解曲线测定:65~95ħ,每0.5ħ读板1次,持续5s㊂
1.5.1㊀细菌处理㊀将细菌培养8-12h后,接种于LB肉汤中,培养至生长对数期(OD600=0.7~0.8)㊂以标准菌株为对照组,安妥沙星诱导后的耐药菌株为试验组㊂
1.5.2㊀总RNA的抽提㊀按试剂盒说明书操作步骤抽提总RNA㊂
1.5.3㊀反转录㊀按GoScript TM Reverse Transcription System反转录试剂盒说明书操作步骤合成cDNA㊂
表2㊀目的基因用于荧光定量PCR 扩增引物
基因引物序列(5ᶄң3ᶄ)退火温度/o C
片段长度/bp
gapA F:TGGTCTGTTCCTGACTGACG
59.8R:TTGTCGAAGTTAGCGCCTTT 60.0123acrA F:CAGATCACAACCGAGCTTCC 60.8R:GCTTCGATGTCGCTACCTTC 60.0116acrB F:CGTTCTCCTCTTCTCGTTGG
60.0R:ATCAGCTCCATTGCTTCACC
60.2124tolC F:GATCTGCTGGCACTGAACAA
60.0R:GCTATCAGGCGCATAACCAT 60.1114acrZ
F:CATGGTACCTGTCGTGATGG
59.8R:TTTGTCCGGGCTGGTCTT ㊀㊀61.6
104
1.5.4㊀荧光定量PCR 检测㊀(1)荧光定量PCR 反应:将cDNA 样品作为模板上机检测㊂反应条件:95ħ30s,95ħ5s,61ħ35s,共40个循环,每次循环读板1次;熔解曲线测定:65~
95ħ,每0.5ħ读板1次,持续5s;(2)熔解曲线:每个样品做3次平行重复;(3)样品扩增曲线:试验设计为组内3次试验,观察试验重复性是否良好㊂
2㊀结果
2.1㊀安妥沙星及其他药物对诱导前后大肠埃希菌MIC 的测定㊀经安妥沙星诱导后的细菌对乳酸环丙沙星㊁恩诺沙星㊁盐酸土霉素和磺胺嘧啶均呈现出高度耐药,对安妥沙星耐药的大肠埃希菌极易对其他氟喹诺酮类药物产生交叉耐药,同时对其他类的抗菌药物也产生了多重耐药(表3)㊂
表3㊀安妥沙星及其他药物对诱导前后菌株的MIC
(μg /mL)
菌株药物名称
安妥沙星恩诺沙星乳酸环丙沙星磺胺嘧啶盐酸土霉素
硫酸庆大霉素
硫酸黏菌素ATCC25922
0.31250.00780.007V810
4
0.250.01A
64
0.32
80
>2560160 6.25
2
2.2㊀安妥沙星诱导前后acrA ㊁acrB ㊁tolC ㊁acrZ 突变情况
2.2.1㊀PCR 扩增结果㊀各基因电泳条带均在相应范围内,且条带单一,说明目的基因被有效扩增且无非特异性条带,可用于后续试验(图
1)㊂图1㊀tolc ㊁acrA ㊁acrB 2㊁acrB 1和acrZ 基因电泳图
M:DNA Marker DL-2000;1~3:阴性对照及ATCC25922㊁A 的
tolC 基因;4~6:阴性对照及ATCC25922㊁A 的acrA 基因;7~9:阴性对照及ATCC25922㊁A 的acrB 2基因;10~12:阴性对照及ATCC25922㊁A 的acrB 1基因;13~15:阴性
对照及ATCC25922㊁A 的acrZ 基因
2.2.2㊀目的基因测序结果㊀由表4可见,与诱导前菌株相应基因序列对比,诱导后的耐药菌株除acrZ 未发生碱基突变外,其余基因均发生碱基突变,其中:acrA 8处㊁acrB 40处㊁tolC 27处㊂但本试验中acrA 碱基位突变,因密码子具有兼并性并没有使氨基酸发生突变;acrB 编码的氨基酸序列只出现了1个位点突变596Asn ңHis;tolC 编码的氨基酸序列出现了3个位点突变,分别是:13Leu ңPhe㊁160Tyr ңAsp㊁482Thr ңSer㊂
2.3㊀安妥沙星处理前后acrA ㊁acrB ㊁tolC ㊁acrZ mR-NA 表达量的变化
2.3.1㊀扩增和熔解曲线的建立㊀实时定量PCR 扩增的基因,系统自动生成扩增曲线和熔解曲线,acrA ㊁acrB ㊁tolC ㊁acrZ 和gapA 的扩增曲线和熔解曲线如图2和图3所示㊂熔解曲线峰单一无杂峰,表明PCR 扩增产物解链温度稳定,PCR 扩增产物单一,引物设计合理,且无非特异性产物,可以进行后续试验㊂
2.3.2㊀安妥沙星诱导前后acrA ㊁acrB ㊁acrZ ㊁tolC mRNA
表4㊀试验菌株目的基因碱基和氨基酸序列突变情况
基因碱基序列
氨基酸序列
acrA 321T ңC 330T ңC
504A ңG 543T ңC 561A ңG 813T ңC 882T ңC 1029C ңT acrB
150T ңC
336G ңA 366T ңA
444T ңC 465T ңC 477A ңG 480G ңT 636T ңC 645A ңG 648T ңG 781C ңT 783A ңG 792T ңC 801A ңG 882G ңA
887T ңC
981T ңC
990A ңG
1062A ңT 1074T ңC
1131T ңG 1461C ңT 1614G ңA 1665G ңA 1786A ңG 1912C ңT
1959T ңC 2027C ңT 2064A ңT
2014T ңC 2472T ңC 2583A ңG 2667A ңG 2676C ңT 2679G ңA 2709A ңG 2808T ңG 2919C ңT 2922A ңG 2938T ңC 596Asn ңHis
tolC
37C ңT 423G ңT
478T ңG 516G ңA 522C ңT 732C ңA 733C ңT
744A ңG 747T ңC 753A ңG 765G ңA 792C ңT
816G ңA
822C ңT 831A ңG
849C ңT
858A ңG
1038G ңA 1080T ңC
1143A ңG 1212C ңT
1227G ңA 1254T ңC 1258C ңT 1275C ңT 1395T ңC 1444A ңT
13Leu ңPhe 160Tyr ңAsp 482Thr ңSer
acrZ
:
没有发生突变
图2㊀
扩增曲线图3㊀熔解曲线
表达量的变化㊀使用2-әәCt 法进行数据分析(图4),与诱导前菌株相应基因mRNA 表达量相比,诱导后菌株acrA ㊁acrB ㊁acrZ ㊁tolC 的mRNA 表达量均极显著增加㊂mRNA 的表达量增加在一定程度上会使得细胞膜上的外排泵蛋白AcrAB-TolC 数量增加,从而更快地将菌体内抗菌药物泵出菌体外,使得大肠埃希菌对多种药物的耐药性增加㊂3㊀讨论
3.1㊀
安妥沙星诱导耐药菌株对多种抗微生物药物
图4㊀安妥沙星处理前后菌株acrA ㊁acrB ㊁
acrZ ㊁tolC mRNA 表达量变化
∗:与ATCC25922相比差异显著(P <0.05);∗∗:与
ATCC25922相比差异极显著(P <0.01)
耐药㊀大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制主要包括:(1)药物作用靶位基因突变;(2)细菌细胞膜通透性改变;(3)主动外排㊂表3中安妥沙星及其他药物对诱导前后大肠埃希菌MIC 结果显
示,经安妥沙星诱导的菌株可同时对乳酸环丙沙星㊁恩诺沙星等氟喹诺酮类药物交叉耐药,同时会对盐酸土霉素㊁硫酸庆大霉素和磺胺嘧啶产生多重耐药,这表明此次安妥沙星诱导所得的耐药菌株其耐药性不具有很强的特异性,对多种抗微生物药物的耐药机制有着共同之处㊂药物主动外排是大肠埃希菌多重耐药的主要机制,外排泵AcrAB-TolC 是大肠埃希菌最为重要的外排泵,也是目前研究比较清楚的细菌外排泵,能够同时外排多种抗菌药物㊁有机溶剂㊁染料及去污剂等使细菌产生高水平多重耐药[5]㊂体外诱导耐药过程中可能也会同时引起其他抗菌药物的耐药基因决定簇/耐药基因位
点发生了变化,Oethinger[6]等研究表明,在敲除ac-rAB的情况下,仅依靠促旋酶突变不能使野生型大肠埃希菌达到临床相关水平的氟喹诺类药物抗性㊂因此外排泵AcrAB-TolC在大肠埃希菌的固有和获得的氟喹诺类药物抗性中起到关键作用㊂
3.2㊀体外诱导的耐药菌株外排泵基因突变及表达量变化㊀由表4可以看出,与原菌株相比,诱导耐药菌株的acrA㊁acrB和tolC基因的碱基序列变化最多,点突变的数量分别是8㊁40和27,且acrB和tolC 基因中都有氨基酸突变㊂Chen[7]等用氟喹诺酮类药物对大肠埃希菌进行体外诱导时,发现诱导后的耐药菌株其acrA/B和tolC的碱基及氨基酸均发生了变化,说明细菌的耐药性与外排泵基因的突变有一定的相关性㊂acrZ基因属于高度保守的基因,此次也未发现其发生突变㊂
外排泵AcrAB-TolC属于RND家族[8-9],由Ac-rA㊁AcrB㊁TolC蛋白组成,以三聚体复合模式存在于细菌的细胞膜上,AcrB为外排转运蛋白,TolC为外膜通道蛋白,AcrA为周质连接蛋白,位于周浆间隙中,两端连接TolC和AcrB,形成一个贯通内外膜的孔道,是药物外排的主要途径㊂在AcrB与底物结合的部位还有一个特殊小蛋白AcrZ[10-11],可通过对AcrB的变构调节来影响AcrB对底物的选择性,从而影响细菌对药物的敏感性㊂图4中acrA㊁acrB㊁acrZ㊁tolC的mRNA表达量均极显著增加,理论上就会产生更多相应的外排泵蛋白㊂Mazzariol[12]等发现10株临床分离的大肠埃希菌中有9株的AcrA过表达ȡ170%,具有高水平的环丙沙星耐药性(MICs,ȡ32μg/mL)㊂Baucheron[13]等的研究表明,AcrB多药转运蛋白在鼠伤寒噬菌体DT204型肠道沙门菌的高水平氟喹诺酮耐药中发挥重要作用㊂Sulavik[14]等的研究表明,敲除acrAB或tolC基因会导致大肠埃希菌的敏感性增加,进一步证实了AcrAB-TolC外排系统在高水平氟喹诺酮类药物耐药中的重要性㊂Hobbs[15]等研究发现,acrZ基因缺失突变体的耐药性显著下降,AcrZ特异性结合AcrB可增强细菌耐药性㊂四种蛋白均过量表达,协调配合形成更多结构和功能完整的外排泵AcrAB-TolC,从而更快地将菌体内抗菌药物泵出菌体外,使得大肠埃希菌对多种药物的耐药性增加,多药耐药程度随表达量增加而增强㊂
安妥沙星体外诱导大肠埃希菌标准菌株,可产生具有多重耐药表型的耐药株,且耐药株对安妥沙星和其他抗微生物药物的多重耐药机制有一定的共同之处,与外排泵蛋白AcrAB-TolC的过量表达有一定的相关性㊂
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