最新Westernblot所需溶液的配制
Western blot 试剂与操作步骤
[主要试剂]1、SDS-PAGE 试剂：2、匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。
3、转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O 定容至1000ml。
4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O 至1000ml。
5、膜染色液：考马斯亮兰0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。
包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml 的0.01M PBS 中。
6、显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H202 1.0μl。
7、兔抗猪R 蛋白抗体、HRP 标记羊抗兔IgG（二抗）。
[操作步骤]1、蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。
然后4℃，13,000g 离心15min。
取上清液作为样品。
2、电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3、转移（半干式转移）：（1）电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3 次。
（2）膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC 膜，浸入转膜缓冲液中10min。
（3）转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24 层滤纸、NC 膜、凝胶、24 层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC 膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g 重物，将碳板上多余的液体吸干。
接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。
转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。
将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s 后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。
WESTERNBLOT常用液体配方
WESTERN BLOT常用液体配方1 、凝胶储备液（30%Acr/Bise）acrylamide 58gBis - acrylamide 2g加超纯水溶解（约100ml）定容至200毫升。
4℃棕色瓶避光保存2 、Gel buffer pH：8.8 （分离胶用）Tris-base 36.3g加超纯水溶解（约100ml）用浓HCL调pH值至8.8加超纯水定容至200ml 4℃保存3 、Gel buffer pH：6.8 （浓缩胶用）Tris-base 12.1g加超纯水溶解（约100ml）用浓HCL调pH值至6.8加超纯水定容至200ml 4℃保存4 、10%APS：过硫酸铵（APS）0.1g加超纯水至1ml新鲜配制，4℃可保存10天。
5 、10%SDS(十二烷基磺酸钠)SDS 10g加超纯水至100ml 室温保存。
6 、10× TBSTris-base 61gNaCl 90g加超纯水溶解调pH值至7.6定容至1000ml7、10×电泳缓冲液（Running buffer）Tris-base 30.3gGlycine 144gSDS 10g加超纯水定容至1000ml8 、转膜液（1000ml）Tris-base 3.03gGlycine 14.4g加超纯水至850ml ，加甲醇150ml9 、杂交液（稀释抗体用）0.05g BSA加TBST至50ml 4℃保存10、TBST 洗膜液1X TBS 1000ml（取900ml 超纯水+ 100ml 10× TBS）加Tween 20 1ml11、封闭液（1%BSA）0.4g BSA加TBST至40ml 摇匀※※必须现用现配※※※※备注：凝胶储备液（30%Acr/Bise）剧毒，操作时请自带口罩，手套。
TEMED有刺激性气味，注意防护。
10X液体为储备液，请稀释至1X使用。
western blot各种液体配制
一、所需试剂的配制1、丙烯酰胺贮存液（30%Acr/Bic）丙烯酰胺（Acr）29.2gN，N-甲叉双丙烯酰胺（Bic）0.8g超纯水至100ml37度溶解，4度避光保存一个月，使用时恢复至室温且无沉淀。
2、分离胶缓冲液（4×）（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：Tris（MW121.14）18.15g超纯水90ml用HCl调pH值至8.8，最后用超纯水定容至100ml，4度保存。
3、浓缩胶缓冲液（4×）（1.0mol/L Tris-HCl，pH6.8）:Tris（MW121.14）12.1g超纯水90ml用HCl调pH值至6.8，最后用超纯水定容至100ml，4度保存。
4、10%十二烷基硫酸钠（SDS）SDS 10g蒸馏水至100ml50度水浴溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶解后仍可使用。
5、10%过硫酸铵（Aps）Aps 0.1g超纯水1ml溶解后4度避光保存，保存时间为一周，现用现配，也可-20度保存6、N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）：避光保存。
7、2×上样缓冲液（2×Loading Buffer）：1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）0.8ml10%SDS（电泳级）2ml溴酚蓝0.5mg甘油0.8ml2-巯基乙醇0.2ml蒸馏水 1.2ml总量为5ml，可在4度存放数周，-20存放数月。
（其中2-巯基乙醇可保护二硫键，并使蛋白下沉用利于电泳的进行。
）8、电泳缓冲液（pH8.3）Tris 3.03g甘氨酸（Gly）14.4gSDS 1g或10%SDS 10ml蒸馏水至1L无需调pH值（8.2~8.3），可在4度存放数周，次溶液可重复使用3~5次。
9、转移缓冲液：Tris 3.03g甘氨酸（Gly）14.4g甲醇200ml蒸馏水至1L先用蒸馏水溶解甘氨酸和Tris，然后再加入甲醇，最后补足液体。
无需调pH值（8.1~8.4），可在4度存放数周。
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。
1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。
1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。
1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。
1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。
1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。
1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。
Westernblot试剂配制及操作流程
Westernblot试剂配制及操作流程试剂配制：1.电泳缓冲液：a. 准备1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液（Tris-Glycine缓冲液）：每一升缓冲液中加入30.3g Tris base、288g glycine，并调节pH至8.3±0.1b. 准备3×SDS-凝胶缓冲液：每一升缓冲液中加入30g Tris base、144g glycine、10g SDS，并调节pH至8.3±0.12.蛋白提取缓冲液：a. 准备RIPA缓冲液：每一升缓冲液中加入5g Tris base、15g NaCl、5g sodium deoxycholate、1g NP-40，并将pH调节至7.4b.按需添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
操作流程：1.样品制备：a. 收集细胞或组织样品，加入适量的蛋白提取缓冲液，并使用超声波细胞破碎仪或玻璃Dounce破碎器破碎细胞，释放蛋白。
b.在4℃下离心细胞提取物，收集上清液，并在离心后尽快使用或存储在-80℃的冰箱中。
2.SDS-凝胶制备：a. 准备15%缩胆凝胶：加入7.5mL 30%丙烯酰胺、10mL 10×SDS-凝胶缓冲液、7.5mL去离子水和20uL 10%Tetramethylethylenediamine (TEMED)，混合均匀。
b.将混合液倒入立方形凝胶模具中，插入两根不锈钢导电丝作为电极，并进一步注入10%胶解剂。
c.待凝胶定形后，用1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液冲洗凝胶表面。
3.蛋白电泳：a.加载样品：将样品加入离心管中，加入1×电泳缓冲液以使样品浓度均匀。
b. 加载样品：将样品加入凝胶孔中，通常每孔加入20-30ug样品。
c.进行电泳：将装有凝胶的电泳槽放入电泳缓冲液中，将蛋白电泳至凝胶顶部。
d.转移凝胶：根据需求选择湿式或半湿式转印方式，将蛋白转移到PVDF或NC膜上。
4.免疫印迹：a.封闭膜：将转印膜放入封闭溶液中（如5%脱脂奶粉或3%BSA）封闭非特异性结合位点。
Western Blot Protocol
Western Blot Protocol1.SDS-PAGE试剂的配制1)40%丙烯酰胺溶液(Acrylamide)2)10%过硫酸铵溶液(APS)3)TEMED4)分离胶缓冲液4X Buffer (pH 8.8)5)浓缩胶缓冲液4X Buffer (pH 6.8)6)10X电泳缓冲液(Running buffer)2.制胶1)10%分离胶的制备ddH2O 4.92ml 9.98mlTris-HCl缓冲液（pH 8.8，1.5mol/l） 2.5ml 5ml40%丙烯酰胺 2.48ml 4.96ml10% APS 100μl 200μlTEMED 4μl 8μl10%分离胶10ml 20ml2)灌注分离胶在加完TEMED后，速在两玻璃板间灌注丙烯酰胺溶液，预留1.5cm灌注浓缩胶（约在夹子高度稍低），应排除凝胶底部玻璃与板间的气泡。
用移液枪在丙烯酰胺溶液上层覆盖无水乙醇约4ml（至溢出），凝胶静置室温30min。
30min后，分离胶聚合凝固，倾倒出上层覆盖的无水乙醇，并用滤纸吸尽残留的液体。
3)5%浓缩胶的制备ddH2O 2.5ml 5mlTris-HCl缓冲液（pH 8.8，1.5mol/l）1ml 2ml40%丙烯酰胺0.46ml 0.92ml10% APS 40μl 80μlTEMED 2μl 4μl浓缩胶4ml 8ml4)灌注浓缩胶在加完TEMED后，迅速在已经聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶至溢出，并立即插入梳子，避免产生气泡。
凝胶静置30min。
浓缩胶聚合凝固，小心拔出梳子，立即用ddH2O洗涤加样槽，以去除未聚合的丙烯酰胺。
3.加样1)蛋白样品变性在浓缩胶聚合的同时，将蛋白抽提液和加样缓冲液在沸水中加热5分钟，使蛋白变性。
2)灌注电泳缓冲液电泳槽中加满电泳缓冲液（ph8.3的Tris-Gly）。
3)蛋白加样用移液枪加样槽中加入样品和分子量蛋白标准品（Markers）。
所有加样槽均加样，空白孔用加样缓冲液代替，第一个孔加Markers5μl，其余孔加样品30μl。
(整理)WesternBlot试剂的准备.
Western Blot试剂的准备1. 30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr） 29.0g亚甲双丙烯酰胺（Bis） 1.0g混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。
2. 4×分离胶缓冲液（1mol/L Tris-HCl PH 8.8）Tris 18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 8.8，定容至100ml。
3. 4×浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-HCl PH 6. 8） Tris 12.1g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 6. 8，定容至100ml。
4. 10%SDS：电泳级SDS 10.0g加ddH2O，68℃助溶，浓盐酸调PH 7.2，定容至100ml。
5. 5×电泳缓冲液（PH 8.3）：Tris 15.2g甘氨酸 94gddH2O 定容到1000mlSDS 5g 先在974ml蒸馏水中加入Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。
6. 10%过硫酸铵（AP）：0.1g AP加ddH2O至1.0ml，4℃保存，要在一周内使用，最好新鲜配制。
7. 2×加样缓冲液：2×SDS加样缓冲液0.5mol/L Tris-HCl (PH 6.8) 2ml10%SDS 4 mlβ-巯基乙醇1ml甘油 2ml1%溴芬蓝1ml置4℃避光保存8. TEMED：注意室温较低时TEMED量可加倍，最后灌胶之前再用9. 转膜缓冲液(Towbin transfer Buffer)：即1×SDS-PAGE10. 0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) ：NaCl 8.5g(12H2O)Na2HPO4 2.9011g(2H2O)NH2PO4 0.24g加ddH2O定容至 1000ml11. 封闭液: 1×PBS中加入 30ml5%（V/V）脱脂奶粉 1.5g0.02%叠氮钠 0.006g0.05%Tween-20 0.015g12. 漂洗液（PBST）：含0.05% Tween-20的PBS溶液每1000 ml PBS溶液中加0.5 ml Tween-2013. 水饱和正丁醇：正丁醇 50 mlddH2O 5 ml 加入瓶中震荡，使结合，存于室温。
western-blot 通用配方
1.Western Blotting 相关溶液及抗体1)转膜缓冲液（running buffer）(10×)(1L)Tris 30.3g甘氨酸144g不调pH转膜工作液（1×)(1L)（现配现用）(10×)转膜缓冲液（running buffer）100ml无水乙醇100ml水800ml2)TBS 缓冲液(5×)（1L）Tris-HCl 12.15gNaCl 146.4g用36-37%浓盐酸调节pH值至约7.4（约5ml浓盐酸，pH试纸检测即可）TBST：TBS+Tween-20 0.1%（1ml for 1L）3) 封闭液TBST 缓冲液中加入5%脱脂奶粉或者(3% Gelatine)4）Western Blotting 第一抗体适合于自己蛋白的抗体5）Western Blotting 第二抗体辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG/(羊抗鼠IgG)4.实验步骤（1）SDS-PAGE 电泳分离蛋白质：(浓缩胶70V，30-40min；分离胶120V，1h)5×loading buffer: 4mlddH2O 1.76ml 1M Tris-HCl pH 6.8 0.24ml甘油1ml 10%（w/v）SDS 0.8mlß-巯基乙醇0.2ml（2）将4 张滤纸剪成与海棉大小一致的方形（3）配（1×)转膜工作液(10×)转膜缓冲液（running buffer）80ml无水乙醇80ml水640ml800ml（4）将胶泡在（1×)转膜工作液中（防止胶干掉，最好不要用水，水泡胶会涨）（5）用尺子量胶大小，裁PDVF膜（不要用手蹭膜，手上有蛋白）（6）PDVF膜先在无水乙醇中泡约1min,然后泡到（1×)转膜工作液中。
（PDVF膜为疏水性的，先在乙醇中泡会使其亲水性好）（7）将海绵和滤纸在水中浸湿，然后按照一下顺序(整个操作过程中保证膜不能干)：白板—海绵—两层滤纸--PDVF膜（靠正极）--胶（靠负极）（用小试管排气泡）--两层滤纸—海绵（用小试管排气泡）--夹住—放入胶槽中（白板靠红，黑板靠黑，保证电极方向不要错）--在胶槽中加入转子—倒入（1×)转膜工作液—在胶槽中放入冰袋—80V～100V 恒压，60min(该条件可以转移25kD～90kD的蛋白)(8)封闭：在封闭液中室温，摇1h或者4℃静置过夜。
Westernblot所需溶液的配制
WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Running buffer) 5×Tris base 15.14gGlycine(甘氨酸) 72.0gSDS 5.0g蒸馏水溶解至1000ml5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。
使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。
2转膜缓冲液（Sending buffer）（现用现配）1000 ml 1500 mlGlycine(甘氨酸) 14.413 g 21.6 g1.0 M Tris.HCl (pH8.3) 25 ml 37.5ml10% SDS 1 ml 1.5 ml甲醇(methanol) 200 ml 300 ml蒸馏水溶解至1000 ml 溶解至1500 ml必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。
小片段可不加SDS。
310% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。
4Tris.HCl的配置1.0M Tris.HCl (pH8.8) Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.81.5 M Tris.HCl (pH8.8) Tris 45.43 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.81.0 M Tris.HCl (pH6.8) Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到6.81.0 M Tris.HCl (pH8.3) Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.3，需要大约8毫升。
注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。
5 10% APS (Ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。
Western blot实验所需试剂配制方法
12. 考马斯亮蓝染色脱色液：
名称 冰醋酸 甲醇 去离子水
用量 100ml 100ml 800ml
备注 充分混匀后使用
13. 2%的丽春红贮备液(20mL)：
名称 丽春红 三氯乙酸
用量 5g 0.4g
备注
磺基水杨酸
6g
充分溶解，定容 20ml
精品
.
制胶： 14、 分离胶的制备（pH 8.8）
15、 浓缩胶的制备（5%Acrylamide）
备注
预实验已确定 加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
5. 10%SDS：
精品
.
名称 SDS 去离子水
用量 10g 80ml
缓冲液配置：
备注 加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
6. 5ⅹTris-Glycine Buffer(SDS-PAGE 电泳缓冲液)
名称 Tris Glycine SDS 去离子水
如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！ 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！
精品
. 精品
定容到 1000ml
备注 室温保存
8. 1ⅹ膜转移缓冲液：
名称 Glycine Tris SDS 甲醇 去离子水
用量
2.9g
2.9g
5.8g
5.8g
0g
0.37g
用前加 200ml 甲醇 用前加 200ml 甲醇
定容到 1000ml
定容到 1000ml
备注 室温保存
9. 5×SDS-PAGE Loading Buffer：
名称 Tris 去离子水 浓盐酸 去离子水
用量 12.1 80ml 8.8-9ml
备注
预实验已确定 加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
weston blot相关试剂配方-机能实验室
Western-Blot试剂配制1母液1.1 1.0mol/L Tris•HClTris (MW121.14) 30.29g、蒸馏水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
1.2 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSFPMSF 0.174g、异丙醇100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。
1.3 0.2mol/L NaH2PO4NaH2PO4（MW119.98）12g蒸馏水至500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
1.4 0.2mol/L Na2HPO4Na2HPO •12H2O（MW 358.14）71.6g，蒸馏水至1000ml，溶解后，高压灭菌，室温保存。
1.5 10％SDSSDS 10g，蒸馏水至100ml，50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
1.6 10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺0.1g，超纯水 1.0ml，溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
时加入超纯水即可）1.7 1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8）Tris (MW121.14) 45.43g，超纯水200ml，溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
1.8 0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8）Tris (MW121.14) 15.14g，超纯水200ml，溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
1.9 40％Acr/Bic（37.5:1）丙稀酰胺（Acr）37.5g、甲叉双丙稀酰胺（Bic）1g，超纯水至100ml溶解后4℃保存。
使用时恢复至室温且无沉淀。
1.10 30％Acr/Bic（29:1）丙稀酰胺（Acr）29g、甲叉双丙稀酰胺（Bic）1g，超纯水至100ml溶解后4℃保存。
使用时恢复至室温且无沉淀。
1.11 20％Tween20Tween20 20ml，蒸馏水至100ml，混匀后4℃保存。
western-blot
一、试剂配置：1、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris+48ml 1mol/L HCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后4℃保存。
2、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40ml水中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4℃保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
3、胶配置：加入TEMED后，立即混匀即可灌胶。
4、封闭液：（含5％脱脂奶粉的TBST 缓冲液）脱脂奶粉（国产，安怡牌）5g+TBST 100ml溶解后4℃保存。
使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。
5、抗体:用TBST 稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml。
二、SDS－PAGE 电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
（2）灌胶与上样1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）2、按前面方法配10％分离胶，加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10ml 枪吸取5ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。
）3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
4、按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。
Westernblotting溶液配制
Western Blotting 所用溶液1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) 500 mlTris-base 90.85 gddH2O 400 ml用浓盐酸调pH 至8.8定容至500 ml，高压灭菌，室温保存。
1 M Tris-HCl (pH 6.8) 500 mlTris-base 60.57 gddH2O 400 ml用浓盐酸调pH 至6.8定容至500 ml，高压灭菌，室温保存。
10%(w/v) AP (过硫酸铵) 20 mlAP 2gddH2O 20 ml分装到1.5ml离心管，1ml/tube，-20°C保存10%(w/v) SDS (十二烷基硫酸钠) 100 mlSDS 10gddH2O 90 ml用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解，用水定容至100ml，室温保存。
10x Running Buffer (电泳缓冲液) 500 ml1X Running Buffer?: 0.025M Tris, 0.25M Glycine, 0.1% SDS10X Running Buffer?: 0.25M Tris, 2.5M Glycine, 1% SDS配方：Tris 15.1 g甘氨酸93.75 gSDS 5.0 gddH2O 400ml，搅拌直至完全溶解后，定容至500ml，室温保存。
电泳时10x Running Buffer取100ml，加ddH2O 900ml，定容至1L，配成1X Running Buffer.1X Running Buffer可反复使用4-5次。
10x Transfer Buffer (转膜缓冲液) 500 ml1X Transfer Buffer: 0.025M Tris, 0.192M Glycine, 0.037% SDS，20% Methanol10X Transfer Buffer: 0.25M Tris, 1.92M Glycine, 0.37% SDS配方：Tris 15.1 g甘氨酸72 gSDS 1.85 gddH2O 400ml，搅拌直至完全溶解后，定容至500ml，4°C保存。
Westernblot所需溶液的配制
WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Running buffer) 5×5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。
使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。
2转膜缓冲液（Sending buffer）（现用现配）必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。
小片段可不加SDS。
310% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate ，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。
4Tris.HCl的配置注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。
5 10% APS (Ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。
使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。
4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。
负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。
6 10×TBS (Tris-buffered saline)的配置加HCl调pH到7.6，室温储存。
7TBST (Tris-buffered saline with Tween20) 的配置8 上样缓冲液（loading buffer）的配置SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。
按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
9 stacking gel buffer (4×)调pH到6.8，加双蒸水到10毫升。
Westernblot试剂配制及操作步骤(最新整理)
Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1)pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。
4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。
4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。
可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。
临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）溴酚蓝Tris-base MilliQ 水100 mg60 mg定容至10 ml8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。
western blot试剂配方
Tris (MW121.14)
30.29g
蒸馏水
200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
Ph
Hcl
7.4
约17ml
7.5
约16ml
7.6
约15ml
8.0
约10ml
（5）10%SDS
SDS
10g
蒸馏水至
Western blotting所需要试剂配方
1、超纯水
2、30%Acr/Bic(29.1)、1.5mol/L Tris.Hcl(Ph=8.8)、0.5mol/L Tris.Hcl(Ph=6.8)、1.0mol/L Tris.Hcl、10%SDS
3、10%AP(使用前加1000ul超纯水)、转移缓冲液、TBS、TBST、TEMED、甲醇、吐温20
5.8g*10
SDS
0.37g*10
甲醇
200ml*10
蒸馏水至
1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。
（8）TBS缓冲液
1 mol/L Tris·HCl（pH7.5）
10ml
NaCl
8.8g
蒸馏水至
1000ml
可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用
（9）TBST缓冲液
20％Tween20
1.65ml
TBS
700ml
混匀后即可使用，最好现用现配
（10）电转缓冲液
Tris（MW121.14）
3.03g
甘氨酸（MW75.07）
Westernblot所需溶液的配制
.WB所需溶液的配制5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。
使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。
必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。
小片段可不加SDS。
310% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,CHONaS）41225溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。
注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。
5 10% APS (Ammonium persulfate ; )的配置过硫酸铵称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。
使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。
4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。
负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。
加HCl调pH到7.6，室温储存。
1 / 3.SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris1:21:1或H2O 32ml混匀备用。
按3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，12.8ml，巯基乙醇，总蛋20-25ul3min比例与蛋白质样品混nonfat dried milk 或者0.01% antifoam A (Sigma)0.01%(v/v) sodium azide丽春红溶液：12 10毫升。
微升冰醋酸，加入0.05克丽春红，用水稀释至100 毫升）（10004%1）多聚甲醛（PFA）的配制微升氢氧化钠，全300毫升水，60度搅拌溶解，加入40克多聚甲醛，加入800毫升。
调1000PBS，加水定容到度，再加入100毫升的10×部溶解后冷却到4 4。
通风橱过滤，度保存。
pH到7.2-7.4步骤：；至7.4pH0.2%NaOHEDTA,10-20首先加毫升的水溶解再加入使溶解，再调应溶解一个再加另外一个；然后分别加入其他成分，去氧胆酸钠开盖后会飞出，2 / 3.戴口罩。
western blot 试剂配制
试剂配制：（一）母液1，1.0mol/L Tris·HClTris (MW121.14) 30.29g蒸馏水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
PH HCl7.4 约17ml7.5 约16m7.6 约15ml8.0 约10ml2，1.74mg/ml (10mmol/L)PMSFPMSF 0.174g异丙醇 100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。
3，0.2mol/L NaH2PO4NaH2PO4（MW119.98） 12g蒸馏水至 500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
4，0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4·12H2O（MW 358.14） 71.6g蒸馏水至 1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
5，10％SDSSDS 10g蒸馏水至 100ml50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
6，10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺 0.1g超纯水 1.0ml溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
7，1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）Tris (MW121.14) 45.43g超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
8，0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8）Tris (MW121.14) 15.14g超纯水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
9，40％Acr/Bic（37.5：1）丙稀酰胺（Acr） 37.5g甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g超纯水至 100ml37℃下溶解后，4℃保存。
使用时恢复至室温且无沉淀。
10， 20％Tween20Tween20 20ml蒸馏水至 100ml混匀后4℃保存。
Westernblot所需溶液的配制
WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Running buffer) 5×5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。
使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。
2转膜缓冲液（Sending buffer）（现用现配）必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。
小片段可不加SDS。
310% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。
4Tris.HCl的配置注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。
5 10% APS (Ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。
使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。
4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。
负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。
6 10×TBS (Tris-buffered saline)的配置加HCl调pH到7.6，室温储存。
7TBST (Tris-buffered saline with Tween20) 的配置8 上样缓冲液（loading buffer）的配置SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。
按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
9 stacking gel buffer (4×)10 5×Sample buffer (10ml)11封闭液的配置Blocking solution 要用TBST配制牛奶5% (w/v) nonfat dried milk 或者1%BSA0.01% antifoam A (Sigma)0.01%(v/v) sodium azide12丽春红溶液：100微升冰醋酸，加入0.05克丽春红，用水稀释至10毫升。
(完整word)Westernblot所需溶液的配制
WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液（Running buffer) 5×5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15。
1g Tris碱和72ｇ甘氨酸,5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。
使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。
2转膜缓冲液（Sending buffer）（现用现配）必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。
小片段可不加SDS。
310％ SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate ,SDS,C12H25O4NaS）溶液： 10g SDS，100ml去离子水配制,50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存.4Tris。
HCl的配置注：Tris的分子量是121。
4。
4度储存。
5 10％ APS (Ammonium persulfate ；过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml,分装到1。
5ml微量离心管中,负30度冻存.使用时尽量现配现用,短期内实验频繁可多配。
4度存则两周内用完，最多不能超过一个月.负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。
6 10×TBS (Tris-buffered saline)的配置加HCl调pH到7.6,室温储存。
7 TBST (Tris—buffered saline with Tween20）的配置8 上样缓冲液（loading buffer）的配置SDS—PAGE加样缓冲液：pH6。
8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12。
8ml，巯基乙醇3。
2ml，0。
05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。
按1:1或1：2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20—25ul，总蛋白量100μg。
9 stacking gel buffer (4×）调pH到6。
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WB所需溶液的配制
1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Running buffer) 5×
5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。
使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。
2转膜缓冲液（Sending buffer）（现用现配）
必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。
小片段可不加SDS。
310% SDS配置
电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。
4Tris.HCl的配置
注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。
5 10% APS (Ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置
称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。
使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。
4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。
负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。
6 10×TBS (Tris-buffered saline)的配置
加HCl调pH到7.6，室温储存。
7TBST (Tris-buffered saline with Tween20) 的配置
8 上样缓冲液（loading buffer）的配置
SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。
按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
9 stacking gel buffer (4×)
10 5×Sample buffer (10ml)
11 封闭液的配置 Blocking solution 要用TBST 配制牛奶
5% (w/v) nonfat dried milk 或者1%BSA
0.01% antifoam A (Sigma)
0.01%(v/v) sodium azide
12 丽春红溶液：
100微升冰醋酸，加入0.05克丽春红，用水稀释至10毫升。
1）4%多聚甲醛（PFA ）的配制 （1000毫升）
40克多聚甲醛，加入800毫升水，60度搅拌溶解，加入300微升氢氧化钠，全部溶解后冷却到4度，再加入100毫升的10×PBS ，加水定容到1000毫升。
调pH 到7.2-7.4。
通风橱过滤，4度保存。
13 组织裂解液
步骤：
首先加10-20毫升的水溶解EDTA,再加入0.2%NaOH 使溶解，再调pH 至 7.4；然后分别加入其他成分，溶解一个再加另外一个；去氧胆酸钠开盖后会飞出，应戴口罩。
14. PBS 的配制（1000毫升） （PH 7.2~7.4）
七年级上册英语语法 1．动词be
（is,am,are
）的用法
我(I)用am, 你(you)用are，is跟着他(he)，她(she)，它(it)。
单数名词用is，复数名词全用are。
变否定，更容易，be后not加上去。
变疑问，往前提，句末问号莫丢弃。
还有一条须注意，句首大写莫忘记。
2．this，that和it用法
(1)this和that是指示代词，it是人称代词。
(2)距离说话人近的人或物用this, 距离说话人远的人或物用that。
如：
This is a flower. 这是一朵花。
(近处)
That is a tree. 那是一棵树。
(远处)
(3)放在一起的两样东西，先说this, 后说that。
如：
This is a pen. That is a pencil. 这是一支钢笔。
那是一支铅笔。
(4)向别人介绍某人时说This is…, 不说That is…。
如：
This is Helen. Helen, this is Tom. 这是海伦，海伦，这是汤姆。
(5)This is 不能缩写, 而That is可以缩写。
如：
This is a bike. That’s a car. 这是一辆自行车。
那是一辆轿车。
(6)打电话时，介绍自己用this, 询问对方用that。
如：
—Hello! Is that Miss Green? 喂，是格林小姐吗？
—Yes, this is. Who’s that? 是的，我是，你是谁？
注意：虽然汉语中使用“我”和“你”，但英语中打电话时绝不可以说：I am…, Are you…？/Who are you?
(7)在回答this或that作主语的疑问句时, 要用it代替this或that。
如：
①—Is this a notebook? 这是笔记本吗？
—Yes, it is. 是的，它是。
②—What’s that? 那是什么？
—It’s a kite. 是只风筝。
3．these和those用法
this, that, these和those是指示代词，these是this的复数形式,指时间,距离较近的或下面要提到的人或事;those是that的复数形式,指时间、距离较远或前面已经提到过的人或事物。
①This is my bed. That is Lily’s bed. 这是我的床。
那是莉莉的床。
②These pictures are good. 那些画很好。
③Are those apple trees? 那些是苹果树吗？
在回答主语是these或those的疑问句时，通常用they代替these或those以避免重复。
如：。