蝙蝠葛碱对阿尔茨海默病小鼠血脑屏障通透性和海马低密度脂蛋白受体相关蛋白1的影响

蝙蝠葛碱对阿尔茨海默病小鼠血脑屏障通透性和海马低密度脂
蛋白受体相关蛋白1的影响
费洪新
【摘要】探讨蝙蝠葛碱(DAU)对阿尔茨海默病(AD)小鼠血脑屏障(BBB)通透性和海马低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)的影响.将雄性小鼠随机分成对照组、模型组、多奈哌齐组、DAU高剂量组、DAU低剂量组.采用小鼠腹腔注射D-半乳糖诱导AD小鼠,连续治疗35d后取材,检测小鼠脑伊文氏蓝(EB)含量,采用免疫组化、实时定量PCR检测海马LRP1表达.与模型组比较,DAU高剂量组AD小鼠BBB通透性明显降低和海马LRP1表达明显增加(P＜0.05).DAU通过上调海马LRP1表达来降低AD小鼠BBB通透性.
【期刊名称】《新余学院学报》
【年(卷),期】2019(024)004
【总页数】4页(P41-44)
【关键词】蝙蝠葛碱;阿尔茨海默病;通透性
【作者】费洪新
【作者单位】新余学院护理与康复学院,江西新余338004
【正文语种】中文
【中图分类】R285
阿尔茨海默病(AD)是一种常见的神经系统退行性疾病，其可以使用多奈哌齐[1]治疗。

机体血脑屏障(BBB)是脑内血液与脑组织的主要屏障之一，其通透性增加与AD有关[2]，BBB主要结构血管内皮细胞可以表达介导β-淀粉样蛋白(Aβ)转运的低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)[3-5]，一旦LRP1表达下调，会促使Aβ向脑内转运[6]，促进AD发生发展。

中药单体蝙蝠葛碱(DAU)可以抑制肾癌细胞增殖[7]、诱导肿瘤细胞自噬[8]、保护海马神经元[9]等，而国内外均未见关于DAU对AD小鼠BBB通透性和海马LRP1的报道。

由此，本研究探讨DAU对AD小鼠BBB通透性和海马LRP1的影响机制。

1材料和方法
1.1仪器和试剂
主要仪器：7500型实时定量PCR仪(美国应用生物系统公司)，HMIAS型彩色分析系统(武汉千屏有限公司)，TGL-16G型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，6100型RT-雷杜酶标仪(美国RT公司)等。

主要试剂：D-半乳糖(Sigma公司)，多奈哌齐(重庆植恩药业有限公司)，LRP1(北京博奥公司)，DAU(成都曼思特生物公司)等。

1.2实验动物
清洁级雄性健康2月龄昆明小鼠41只，体质量(22±2)g，购于黑龙江中医药大学[SCXK(黑)2013-012]，常规饲养于黑龙江中医药大学安全评价中心。

1.3模型制备
健康2月龄昆明小鼠41只，按随机数字表分出8只为对照组，余下33只参考文献[10-11]制备AD小鼠模型，小鼠麻醉，去除头毛发，固定，腹腔注射D-半乳糖(终浓度180mg/kg)。

纳入实验33只小鼠有1只造模失败，将剩余造模成功32只AD模型小鼠按照随机数字表分模型组、多奈哌齐组、DAU高剂量组、DAU低
剂量组。

1.4各组给药
对照组、模型组给予生理盐水灌胃，多奈哌齐组给予多奈哌齐(0.001g/kg)灌胃，DAU高剂量组给予DAU(2.0g/kg)灌胃，DAU低剂量组给予DAU(1.0g/kg)灌胃，连续灌胃35d。

1.5检测BBB通透性
小鼠灌胃结束后，固定小鼠，小鼠尾静脉注射伊文氏蓝(EB)(2%)，麻醉小鼠，左心室灌注生理盐水70mL，使用生理盐水冲洗，冰台上取脑，记录脑湿重，恒温52℃烘烤72h，记录脑干重。

将脑置于甲酰胺溶液中浸泡、45℃避光孵育72h，匀浆，3000rpm/min离心10min，在酶标仪上630nm处测定上清液吸光度值(A)并求
出EB含量，用脑EB含量表示BBB通透性。

计算公式：EB含量=EB浓度/脑湿重(μg/g)。

1.6检测海马LRP1表达
各组小鼠灌胃给药结束后，固定小鼠，左心室灌注生理盐水70mL，使用生理盐水冲洗，然后对小鼠进行心脏灌注10%甲醛，按照免疫组化试剂盒说明书进行操作，包括制备小鼠脑石蜡切片、脱蜡、过氧化物酶处理、封闭、滴加抗体、显色、复染、透明、封片等步骤，计算分析各组小鼠海马积分光密度值。

1.7检测海马LRP1基因表达
各组小鼠灌胃给药结束后，固定小鼠，处死小鼠，取材小鼠海马，按照Trizol试
剂盒方法提取海马总RNA，反转录合成cDNA，PCR扩增。

设计β-actin、LRP1 mRNA引物：β-actin(上游：5′-TCATCACTATTGGCAACGAGC-3′，下游：5′-AAC AGTCCGCCTAGAAGCAC-3′)；LRP1(上游：5′-CCCTGGCCATGGCGGCGAAG -3′，下游：5′-CCGGTCAGGGTGGGCTGCG-3′)。

由上海生工生物工程股份有限公司合成引物。

反应体系50μL，95℃ 5min、94℃
15 s、55℃ 45 s，循环40次，使用iQTM5软件分析PCR样本Ct值，按照公式(2-△△Ct法)计算LRP1相对表达量。

1.8统计分析
各组实验数据用SPSS19.0软件处理，数据用表示，组间用单因素方差分析各组数据。

2结果与讨论
2.1BBB通透性结果
AD发病机制比较复杂，其会出现BBB血管内皮细胞结构损伤，导致BBB通透性异常。

在本实验中，与对照组比较，模型组小鼠脑EB浓度、脑EB含量明显增加(P<0.05)，说明模型组小鼠脑组织出现损伤，尤其是BBB血管内皮细胞结构出现损伤，血管内皮细胞紧密连接结构破坏，血管内皮细胞间隙增加且同时伴有血管内皮细胞吞饮作用增强，促使EB易于通过BBB进入脑内，引起脑内EB浓度、脑EB含量增加。

经过多奈哌齐和DAU治疗后，与模型组比较，多奈哌齐组、DAU 高剂量组小鼠脑EB浓度、脑EB含量明显降低(P<0.05)，说明多奈哌齐和DAU 高剂量均可以改善BBB血管内皮细胞结构，减少EB进入脑内，进而改善AD小鼠BBB通透性，但DAU低剂量对小鼠脑EB浓度、脑EB含量的影响甚微，说明DAU低剂量不能改善小鼠脑BBB通透性，由此，可以初步分析DAU高剂量可以改善AD小鼠脑BBB通透性，这对于治疗AD小鼠是积极的。

具体结果见表1。

表1各组小鼠BBB通透性结果组别剂量(g/kg)EB浓度(μg/ml)脑湿重(mg)EB含量(μg/g)对照组 - 0.2539±0.0655310.9617±31.01570.8262±0.2403模型组 -0.5781±0.1077∗316.4333±10.75451.8267±0.3251∗多奈哌齐组
0.0010.3575±0.0776#333.6167±12.59551.0497±0.2057#DAU高剂量组 2.0
0.3529±0.0448#311.4333±13.75661.1326±0.1311#DAU低剂量组
1.00.5396±0.0669∗∗330.9333±19.92131.6429±0.2818∗∗
注：与对照组比较*P<0.05,与模型组比较#P<0.05，**P>0.05
2.2海马LRP1表达结果
DAU可以改善AD小鼠脑BBB通透性，但是其是如何改善AD小鼠脑BBB通透
性的呢？为解决这一问题，需要检测与脑BBB通透性密切相关的LRP1积分光密
度值、mRNA相对表达量。

在本实验中，与对照组比较，模型组小鼠海马LRP1
积分光密度值、mRNA相对表达量明显降低(P<0.05)，提示LRP1表达下降，Aβ易于进入脑内，引起脑血管内皮细胞结构损伤，促使脑BBB通透性增加，可见
AD小鼠脑BBB通透性增加的同时伴有LRP1表达下调，预示脑BBB通透性与LRP1表达存在相关性。

经过多奈哌齐和DAU治疗后，与模型组比较，多奈哌齐组、DAU高剂量组小鼠海马LRP1积分光密度值、mRNA相对表达量明显增加(P<0.05)，提示LRP1表达增加，Aβ不易于进入脑内，不会引起脑血管内皮细胞
结构损伤，将会导致脑BBB通透性降低，可见AD小鼠脑BBB通透性降低的同时伴有LRP1表达上调，而DAU低剂量组小鼠海马关键蛋白LRP1表达改变不明显。

具体结果见表2。

表2各组小鼠海马LRP1表达组别剂量(g/kg)积分光密度值(103,值)mRNA相对表达量(2-ΔΔCt,值)对照组-2.2388±0.16301.0142±0.1832模型组-
1.4875±0.1236∗0.5810±0.1428∗多奈哌齐组
0.0012.0375±0.1193#0.9533±02290#DAU高剂量组
2.02.0013±0.1346#0.9592±0.2019#DAU低剂量组
1.01.6338±0.0828∗∗0.6364±0.1990∗∗
注：与对照组比较*P<0.05,与模型组比较#P<0.05，**P>0.05
3结论
AD小鼠脑BBB通透性增加的同时伴有LRP1表达下调，反之，AD小鼠脑BBB
通透性降低的同时伴有LRP1表达上调，说明DAU通过抑制海马LRP1表达来改
善AD小鼠BBB通透性，这为DAU通过LRP1信号通路来防治AD奠定了基础。

参考文献：
【相关文献】
[1]Cheng J，Yang H，Zhang J. Donepezils Effects on Brain Functions of Patients With Alzheimer Disease：A Regional Homogeneity Study Based on Resting-State Functional Magnetic Resonance Imaging[J]. Clin Neuropharmacol，2019，42(2)：42-48.
[2]Aluganti Narasimhulu C，Mitra C，Bhardwaj D，et al. Alzheimer's Disease Markers in Aged ApoE-PON1 Deficient Mice[J]. J Alzheimers Dis，2019，67(4)：1353-1365.
[3]Lahiri S，Regis GC，Koronyo Y，et al. Acute neuropathological consequences of short-term mechanical ventilation in wild-type and Alzheimer's disease mice[J]. Crit Care，2019，23(1)：63.
[4]Tachibana M，Holm ML，Liu CC，et al. APOE4-mediated amyloid-β pathology depends on its neuronal receptor LRP1[J]. J Clin Invest，2019，129(3)：1272-1277.
[5]Ma Q，Zhao Z，Sagare AP，et al. Blood-brain barrier-associated pericytes internalize and clear aggregated amyloid-β42 by LRP1-dependent apolipoprotein E isoform-specific mechanism[J]. Mol Neurodegener，2018，13(1)：57.
[6]Seok H，Lee M，Shin E，et al. Low-dose pioglitazone can ameliorate learning and memory impairment in a mouse model of dementia by increasing LRP1 expression in the hippo campus[J]. Sci Rep，2019，9(1)：4414.
[7]Zhang S，Ren Y，Qiu J. Dauricine inhibits viability and induces cell cycle arrest and apoptosis via inhibiting the PI3K/Akt signaling pathway in renal cell carcinoma cells[J].
Mol Med Rep，2018，17(5)：7403-7408.
[8]Law BY，Mok SW，Chan WK，et al. Hernandezine，a novel AMPK activator induces autophagic cell death in drug-resistant cancers[J]. Oncotarget，2016，7(7)：8090-104. [9]张英博，费洪新，郭家，等.蝙蝠葛碱对阿尔茨海默病小鼠海马晚期糖基化终产物受体和核转录
因子-κBp65的影响[J].中国老年学杂志，2017，37(19)：4697-4700.
[10]Chogtu B，Arivazhahan A，Kunder SK，et al. Evaluation of Acute and Chronic Effects of D-Galactose on Memory and Learning in Wistar Rats[J]. Clin Psycho pharmacol Neurosci，2018，16(2)：153-160.
[11]Liang CJ，Li JH，Zhang Z，et al. Suppression of MIF-induced neuronal apoptosis may
underlie the therapeutic effects of effective components of Fufang Danshen in the treatment of Alzheimer's disease[J]. Acta Pharmacol Sin，2018，39(9)：1421-1438.。