生物制品无菌试验规程
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3.3.
1.5混浊和接种后不能判定结果的制品，可取规定量的样品接种于不含琼脂 的硫乙醇酸盐培养基（200ml）内进行增菌培养，3～4天后移种。培养基种类 和支数、培育温度同
3.3.
1.2项，共培育8天后判定结果。
3.3.2血液制品
3.3.
2.1取规定抽样数，按下列规定，从每瓶抽取样品，并全部接种完。
0.5ml。将硫乙醇酸盐培养基、适宜的琼脂斜面各1管置30～35℃培育，其余各管置20～25℃培育，培育时间除有专门规定者外共为8天。
3.3.
1.3不含防腐剂制品，装量在
5.0ml以下者（包括
5.0ml）每10xx瓿混合，装量在
5.0ml以上者每7支安瓿混合，将混合后的样品直接接种一组培养基，分别 置20～25℃、30～35℃培育，培育时间共为8天。
0.1%，但不得少于
1.0ml。
1.1.1大罐稀释的制品抽样数量不得少于10ml。
1.1.2原液及半成品每开瓶一次，应如上法抽验。
1.2成品
每亚批均应进行无菌试验，样品应随机抽取，应具有代表性（包括分装过 程的前、中、后样品）。
1.2.1分装量在100支（瓶）或以下者抽检不少于5支，101～500支（瓶）者抽检不少于10支（瓶），501～100支（瓶）者抽检不少于20支（瓶，10001支（瓶）以上者抽检40支（瓶）。
4.3成品无菌试验不合格的亚批数占整批的30%以上时，由质量检定部门会 同有关部门根据具体情况，全部或部分废弃。
附录1无菌试验培养基处方
1硫乙醇酸盐培养基
酵母浸出粉（或酵母透析液200ml）
葡萄糖
氯化钠
L-胱氨酸（或半胱氨酸盐）
硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸
0.6ml）
xx
去离子水（或蒸馏水）
最后pH
7.1±
0.1%蛋白胨水作10倍系列稀释。
3.3将10-6～10-8（短芽胞杆菌、生子孢梭状芽胞杆菌为10-6～10-8，乙型溶血性-7-9
链球菌为10～10）菌液各1ml分别接种到9ml（用于厌氧菌的培养基在试管中装置高度不得低于7cm）试验用培养基中，每个稀释度至少接种3管，并 用未接种的培养基做对照，将接种乙型溶血性链球菌、生子孢梭状芽胞杆菌的 培养基，置30～35℃培育3天，接种短芽胞杆菌的培养基培育5天，记录结 果。
3.2将菌接种在土豆培养基上，20～25℃培养5～7天后用灭菌生理盐水洗 下菌苔，移入装有玻璃珠的大管中将孢子打散，经装有脱脂棉注射器过滤。将 菌液稀释至与标准比浊管相同之浓度，然后做10倍系列稀释。
3.3将10-5～10-7菌液各1ml分别接种到9ml试验培养基中，每个稀释度至 少接种3管并用未接种过的培养基作对照，20～25℃培育5天，逐日观察结 果。
0.2
2硫乙醇酸盐培养基（不含xx）
酵母浸出粉（或酵母透析液200ml）
葡萄糖
氯化钠
L-胱氨酸（或半胱氨酸盐）硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸0.6ml）去离子水（或蒸馏水） 最后pH
7.1±
0.2
3改良xx培养基
葡萄糖
蛋白胨 酵母浸出粉（或酵母透析液 磷酸氢二钾 硫酸镁（含7分子结晶水） 去离子水（或蒸馏水） 最后pH
4结果判定
以接种后培养基管数的以上呈现生长的最高稀释度为该培养基的灵敏度，3次试验中，以2次达到的最高灵敏度为判定标准。
附录3霉菌无菌试验培养基灵敏度试
验法
1菌种
白色念珠菌、腊叶芽枝霉，由中国药品生物制品检定所分发。
2培养基
凡应用于霉菌无菌试验用的培养基都应进行灵敏度试验。
3操作
3.1操作霉菌的无菌室应与其他无菌室隔离，有2个以上菌株试验时，不应 在同一无菌操作室内同时进行。
胰酪蛋白胨（或酪素胰酶消化液，以总氮计2000mg）15g
4猪胃消化液
半固体培养基
猪胃消化液
1:2牛肉浸液
氯化钠
葡萄糖
琼脂
牛心消化液
酵母浸膏
琼脂500ml
500ml
2.5g
1g
3～4g
1000ml
1g
3～4g
附录2需-厌氧菌无菌试验培养基灵敏
度试验法
1菌种
1.1需氧菌
乙型溶血性链球菌（32210株），短芽胞杆菌（7316株）
样品每瓶装量不足
1.0ml者，抽取全量，1～20ml以下者（不含20ml），抽取
1.0ml以上，每支装量为15ml的培养基，接种
1.0ml。
样品每瓶装量以下者（不含）抽取
5.0ml以上,100ml及以上者按15%抽样，每支装量为40ml的培养基，接种
5.0ml。
应接种的培养基支数依取样的总量而定。接种硫乙醇酸盐培养基与改良马 丁培养基支数之比为2:1。
1.2厌氧菌
生孢子梭状芽胞杆菌（64941株）。
以上菌株均由中国药品生物制品检定所分发。
2培养基
凡应用于无菌试验的培养基（增菌和试验用）都应进行灵敏度试验。
3操作
3.1不应在同一无菌操作室内同时操作2个菌株。
3.2将菌种接种于适宜的培养基，经30～35℃培育一定时间（乙型溶血性链球菌和生孢子梭状芽胞杆菌培育24～48小时，短芽胞杆菌培育18～20小时） 后，将乙型溶血性链球菌和短芽胞杆菌分别刮入灭菌的生理盐水内制成均匀菌 液，生子孢梭状芽胞杆菌先将菌液吸入灭菌的试管内，再用灭菌生理盐水稀释 适宜浓度制成均匀菌液，再将菌液稀释至与标准比浊管相同之浓度。然后用
接种后将硫乙醇酸盐培养基总支数的置30～35℃培育，其余置20～25℃培育，改良马丁培养基置20～25℃培育，培育时间不少于14天。
3.4薄膜过滤法
滤膜xx为
0.22～
0.3μm。
取规定抽检样品数，每瓶装量100ml及100ml以下者取全量，100ml以上 者取半量加入灭菌薄膜过滤器内，加压或减压过滤。如为含汞防腐剂者，在样 品过滤后，应用灭菌生理盐水或其他适宜溶剂冲洗滤膜3次，每次100ml。过滤后，无菌取出滤膜，分别放入硫乙醇酸盐培养基2支及改良马丁培养基1支 （每支装量不少于40ml，高度不得低于7cm）。如果使用一个过滤装置，则将该膜剪成三等分，分别放入规定培养基中。将滤膜放入培养基后，一支硫乙醇 酸盐培养基置30～35℃培育，其余各支培养基置20～25℃培育。培育时间不少于7天。
2.2检查需氧性和厌氧性杂菌应采用硫乙醇酸盐培养基。检查不含汞类防腐 剂制品中的需氧性和厌氧性杂菌时，该培养基中可不加硫乙醇酸盐。
检查霉菌和腐生菌应采用改良马丁培养基。检查混浊制品可采用不含琼脂 的硫乙醇酸盐培养基。检查活菌苗时可加大琼脂含量，做成斜面。
2.3检查支原体应采用猪胃消化液半固体或牛心消化液半固体培养基。
4结果判定
以接种培养基管数的以上呈现生长的最高稀释度为该培养基的灵敏度，3次
试验中以2次达到的最高灵敏度为判定标准。
3.3.
1.4支原体培养基临用时将半固体煮沸10～15分钟后，冷却到56℃左右，加入未灭能马血清或灭能小牛血清和酵母浸液（或醋酸铊，充分摇匀，等冷至35～37℃时
种入待检样品
0.5～
1.0ml，共接种2支培养基，置35～37℃培育14天。
2、3）。
2.7各生产单位的质量检定部门应定期抽检无菌试验培养基的灵敏度，检定 所应定期抽检各所的无菌试验培养基。
3无菌试验方法
3.1无菌试验取样、移种等全部操作，应在无菌操作室内或无菌条件下进 行，无菌操作室应经常保持清洁，在每次操作前，应彻底消毒。
3.2菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素类制品及粘稠不易过滤的血液制品应用直 接接种法进行无菌试验。人白蛋白及人丙种球蛋白（包括各种剂型及应用途径 的制品）应用薄膜过滤法进行无菌试验，其他血液制品亦可用薄膜过滤法或直 接接种法进行。
6.4±
0.25g
5g
2.5g
0.5g
0.5g
0.65～
0.75g加至1000ml5g
5g
2.5g
0.5g
0.5g
加至1000ml20g
5g
2g
1g
0.5g
加至1000ml胰酪蛋白胨（或酪素胰酶消化液，以总氮计2000mg）15g新鲜配制的
0.1%刃天青溶液（或
0.2%美蓝溶液
0.5ml）
1.0ml
生物制品无菌试验规程
生物制品不得含有杂菌（有专门规定者除外），灭活菌苗、疫苗不得含有
活的本菌、本毒。在制造过程中应由制造部门按各制品制造及检定规程规定进 行无菌试验，分装后的制品须经质量检定部门做最后检定。各种生物制品的无 菌试验除有专门规定者外，均应按照本规程的规定进行。
1抽样
1.1原液及半成品
原液及半成品应每瓶分别进行无菌试验，其抽样量应至少为
1.2.2每瓶装量20ml以上的冻干血液制品，每柜冻干200瓶以下者抽检2瓶，200瓶及以上者抽检4瓶。6～20ml抽检量加倍。5ml和5ml以下者按
1.2.1项抽检。
1.3凡规定需作支原体检查的制品，均应在半成品时按亚批进行检查，成品 可不再做。
2无菌试验用培养基（培养基处方可附录1）
2.1检查制品中本菌是否存活应采用适于本菌发育生长的培养基（在半成品 时检查，有专门规定者除外）。
2.4生物制品无菌试验用培养基亦可用经检定合格的干燥培养基配制。
2.5无菌试验培养基的灵敏度，乙型溶血性链球菌（32210株）应达到10-8，短芽胞杆菌（7316株）和生孢子梭状芽胞杆菌（64941株）应达到10-7，白 色念珠菌（ATCc10231）和腊叶芽枝霉应达到10-6。
2.6生物制品无菌试验培养基由质量检定部门与培养基制造部门会同进行灵 敏度试验。每当更换主要原材料时，应进行灵敏度试验，合格后方可应用（灵 敏度试验法见附录
3.3直接接种法
3.3.1菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素类制品
3.3.
1.1每安瓿装量
5.0ml以上者（不含
5.0ml）取样不应少于
1.0ml，装量在
5.0ml以下者（含
5.0ml）取样不得少于
0.5ml，装量不足
0.5ml者，全部吸取。
3.3.
1.2含防腐剂的制品，接种量与培养基的比例：
用苯酚或氯仿作防腐剂者至少为1:20，用汞作防腐剂者或制品内含有甲 醛、抗生素者至少为1:50。先按此比例接种于硫乙醇酸盐培养基内增菌，于20～25℃培育3～4天后移种至硫乙醇酸盐培养基、适宜的琼脂斜面、改良马丁 培养基各2管，每管
最好采用全封闭式一次性微孔过滤集菌器，要求每支培养器培养装量为100ml。
3.5检查厌氧性杂菌用培养基需加热驱氧者，必须冷却到45℃以下再行接种。
3.6冻干制品按使用说明书或瓶签规定的稀释量稀释后进行无菌试验
4判定
4.1无杂菌生长判为合格（有专门规定者除外）。
4.2无菌试验发现杂菌生长，可复试。该制品量应加倍。若复试仍有同样杂 菌生长，该制品判为不合格。如为不同杂菌生长，可第二次复试，复试样品为 第一次复试量的2倍，若仍有杂菌生长该制品判为不合格。支原体阳性者不复 试，该批制品判为不合格。
1.5混浊和接种后不能判定结果的制品，可取规定量的样品接种于不含琼脂 的硫乙醇酸盐培养基（200ml）内进行增菌培养，3～4天后移种。培养基种类 和支数、培育温度同
3.3.
1.2项，共培育8天后判定结果。
3.3.2血液制品
3.3.
2.1取规定抽样数，按下列规定，从每瓶抽取样品，并全部接种完。
0.5ml。将硫乙醇酸盐培养基、适宜的琼脂斜面各1管置30～35℃培育，其余各管置20～25℃培育，培育时间除有专门规定者外共为8天。
3.3.
1.3不含防腐剂制品，装量在
5.0ml以下者（包括
5.0ml）每10xx瓿混合，装量在
5.0ml以上者每7支安瓿混合，将混合后的样品直接接种一组培养基，分别 置20～25℃、30～35℃培育，培育时间共为8天。
0.1%，但不得少于
1.0ml。
1.1.1大罐稀释的制品抽样数量不得少于10ml。
1.1.2原液及半成品每开瓶一次，应如上法抽验。
1.2成品
每亚批均应进行无菌试验，样品应随机抽取，应具有代表性（包括分装过 程的前、中、后样品）。
1.2.1分装量在100支（瓶）或以下者抽检不少于5支，101～500支（瓶）者抽检不少于10支（瓶），501～100支（瓶）者抽检不少于20支（瓶，10001支（瓶）以上者抽检40支（瓶）。
4.3成品无菌试验不合格的亚批数占整批的30%以上时，由质量检定部门会 同有关部门根据具体情况，全部或部分废弃。
附录1无菌试验培养基处方
1硫乙醇酸盐培养基
酵母浸出粉（或酵母透析液200ml）
葡萄糖
氯化钠
L-胱氨酸（或半胱氨酸盐）
硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸
0.6ml）
xx
去离子水（或蒸馏水）
最后pH
7.1±
0.1%蛋白胨水作10倍系列稀释。
3.3将10-6～10-8（短芽胞杆菌、生子孢梭状芽胞杆菌为10-6～10-8，乙型溶血性-7-9
链球菌为10～10）菌液各1ml分别接种到9ml（用于厌氧菌的培养基在试管中装置高度不得低于7cm）试验用培养基中，每个稀释度至少接种3管，并 用未接种的培养基做对照，将接种乙型溶血性链球菌、生子孢梭状芽胞杆菌的 培养基，置30～35℃培育3天，接种短芽胞杆菌的培养基培育5天，记录结 果。
3.2将菌接种在土豆培养基上，20～25℃培养5～7天后用灭菌生理盐水洗 下菌苔，移入装有玻璃珠的大管中将孢子打散，经装有脱脂棉注射器过滤。将 菌液稀释至与标准比浊管相同之浓度，然后做10倍系列稀释。
3.3将10-5～10-7菌液各1ml分别接种到9ml试验培养基中，每个稀释度至 少接种3管并用未接种过的培养基作对照，20～25℃培育5天，逐日观察结 果。
0.2
2硫乙醇酸盐培养基（不含xx）
酵母浸出粉（或酵母透析液200ml）
葡萄糖
氯化钠
L-胱氨酸（或半胱氨酸盐）硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸0.6ml）去离子水（或蒸馏水） 最后pH
7.1±
0.2
3改良xx培养基
葡萄糖
蛋白胨 酵母浸出粉（或酵母透析液 磷酸氢二钾 硫酸镁（含7分子结晶水） 去离子水（或蒸馏水） 最后pH
4结果判定
以接种后培养基管数的以上呈现生长的最高稀释度为该培养基的灵敏度，3次试验中，以2次达到的最高灵敏度为判定标准。
附录3霉菌无菌试验培养基灵敏度试
验法
1菌种
白色念珠菌、腊叶芽枝霉，由中国药品生物制品检定所分发。
2培养基
凡应用于霉菌无菌试验用的培养基都应进行灵敏度试验。
3操作
3.1操作霉菌的无菌室应与其他无菌室隔离，有2个以上菌株试验时，不应 在同一无菌操作室内同时进行。
胰酪蛋白胨（或酪素胰酶消化液，以总氮计2000mg）15g
4猪胃消化液
半固体培养基
猪胃消化液
1:2牛肉浸液
氯化钠
葡萄糖
琼脂
牛心消化液
酵母浸膏
琼脂500ml
500ml
2.5g
1g
3～4g
1000ml
1g
3～4g
附录2需-厌氧菌无菌试验培养基灵敏
度试验法
1菌种
1.1需氧菌
乙型溶血性链球菌（32210株），短芽胞杆菌（7316株）
样品每瓶装量不足
1.0ml者，抽取全量，1～20ml以下者（不含20ml），抽取
1.0ml以上，每支装量为15ml的培养基，接种
1.0ml。
样品每瓶装量以下者（不含）抽取
5.0ml以上,100ml及以上者按15%抽样，每支装量为40ml的培养基，接种
5.0ml。
应接种的培养基支数依取样的总量而定。接种硫乙醇酸盐培养基与改良马 丁培养基支数之比为2:1。
1.2厌氧菌
生孢子梭状芽胞杆菌（64941株）。
以上菌株均由中国药品生物制品检定所分发。
2培养基
凡应用于无菌试验的培养基（增菌和试验用）都应进行灵敏度试验。
3操作
3.1不应在同一无菌操作室内同时操作2个菌株。
3.2将菌种接种于适宜的培养基，经30～35℃培育一定时间（乙型溶血性链球菌和生孢子梭状芽胞杆菌培育24～48小时，短芽胞杆菌培育18～20小时） 后，将乙型溶血性链球菌和短芽胞杆菌分别刮入灭菌的生理盐水内制成均匀菌 液，生子孢梭状芽胞杆菌先将菌液吸入灭菌的试管内，再用灭菌生理盐水稀释 适宜浓度制成均匀菌液，再将菌液稀释至与标准比浊管相同之浓度。然后用
接种后将硫乙醇酸盐培养基总支数的置30～35℃培育，其余置20～25℃培育，改良马丁培养基置20～25℃培育，培育时间不少于14天。
3.4薄膜过滤法
滤膜xx为
0.22～
0.3μm。
取规定抽检样品数，每瓶装量100ml及100ml以下者取全量，100ml以上 者取半量加入灭菌薄膜过滤器内，加压或减压过滤。如为含汞防腐剂者，在样 品过滤后，应用灭菌生理盐水或其他适宜溶剂冲洗滤膜3次，每次100ml。过滤后，无菌取出滤膜，分别放入硫乙醇酸盐培养基2支及改良马丁培养基1支 （每支装量不少于40ml，高度不得低于7cm）。如果使用一个过滤装置，则将该膜剪成三等分，分别放入规定培养基中。将滤膜放入培养基后，一支硫乙醇 酸盐培养基置30～35℃培育，其余各支培养基置20～25℃培育。培育时间不少于7天。
2.2检查需氧性和厌氧性杂菌应采用硫乙醇酸盐培养基。检查不含汞类防腐 剂制品中的需氧性和厌氧性杂菌时，该培养基中可不加硫乙醇酸盐。
检查霉菌和腐生菌应采用改良马丁培养基。检查混浊制品可采用不含琼脂 的硫乙醇酸盐培养基。检查活菌苗时可加大琼脂含量，做成斜面。
2.3检查支原体应采用猪胃消化液半固体或牛心消化液半固体培养基。
4结果判定
以接种培养基管数的以上呈现生长的最高稀释度为该培养基的灵敏度，3次
试验中以2次达到的最高灵敏度为判定标准。
3.3.
1.4支原体培养基临用时将半固体煮沸10～15分钟后，冷却到56℃左右，加入未灭能马血清或灭能小牛血清和酵母浸液（或醋酸铊，充分摇匀，等冷至35～37℃时
种入待检样品
0.5～
1.0ml，共接种2支培养基，置35～37℃培育14天。
2、3）。
2.7各生产单位的质量检定部门应定期抽检无菌试验培养基的灵敏度，检定 所应定期抽检各所的无菌试验培养基。
3无菌试验方法
3.1无菌试验取样、移种等全部操作，应在无菌操作室内或无菌条件下进 行，无菌操作室应经常保持清洁，在每次操作前，应彻底消毒。
3.2菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素类制品及粘稠不易过滤的血液制品应用直 接接种法进行无菌试验。人白蛋白及人丙种球蛋白（包括各种剂型及应用途径 的制品）应用薄膜过滤法进行无菌试验，其他血液制品亦可用薄膜过滤法或直 接接种法进行。
6.4±
0.25g
5g
2.5g
0.5g
0.5g
0.65～
0.75g加至1000ml5g
5g
2.5g
0.5g
0.5g
加至1000ml20g
5g
2g
1g
0.5g
加至1000ml胰酪蛋白胨（或酪素胰酶消化液，以总氮计2000mg）15g新鲜配制的
0.1%刃天青溶液（或
0.2%美蓝溶液
0.5ml）
1.0ml
生物制品无菌试验规程
生物制品不得含有杂菌（有专门规定者除外），灭活菌苗、疫苗不得含有
活的本菌、本毒。在制造过程中应由制造部门按各制品制造及检定规程规定进 行无菌试验，分装后的制品须经质量检定部门做最后检定。各种生物制品的无 菌试验除有专门规定者外，均应按照本规程的规定进行。
1抽样
1.1原液及半成品
原液及半成品应每瓶分别进行无菌试验，其抽样量应至少为
1.2.2每瓶装量20ml以上的冻干血液制品，每柜冻干200瓶以下者抽检2瓶，200瓶及以上者抽检4瓶。6～20ml抽检量加倍。5ml和5ml以下者按
1.2.1项抽检。
1.3凡规定需作支原体检查的制品，均应在半成品时按亚批进行检查，成品 可不再做。
2无菌试验用培养基（培养基处方可附录1）
2.1检查制品中本菌是否存活应采用适于本菌发育生长的培养基（在半成品 时检查，有专门规定者除外）。
2.4生物制品无菌试验用培养基亦可用经检定合格的干燥培养基配制。
2.5无菌试验培养基的灵敏度，乙型溶血性链球菌（32210株）应达到10-8，短芽胞杆菌（7316株）和生孢子梭状芽胞杆菌（64941株）应达到10-7，白 色念珠菌（ATCc10231）和腊叶芽枝霉应达到10-6。
2.6生物制品无菌试验培养基由质量检定部门与培养基制造部门会同进行灵 敏度试验。每当更换主要原材料时，应进行灵敏度试验，合格后方可应用（灵 敏度试验法见附录
3.3直接接种法
3.3.1菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素类制品
3.3.
1.1每安瓿装量
5.0ml以上者（不含
5.0ml）取样不应少于
1.0ml，装量在
5.0ml以下者（含
5.0ml）取样不得少于
0.5ml，装量不足
0.5ml者，全部吸取。
3.3.
1.2含防腐剂的制品，接种量与培养基的比例：
用苯酚或氯仿作防腐剂者至少为1:20，用汞作防腐剂者或制品内含有甲 醛、抗生素者至少为1:50。先按此比例接种于硫乙醇酸盐培养基内增菌，于20～25℃培育3～4天后移种至硫乙醇酸盐培养基、适宜的琼脂斜面、改良马丁 培养基各2管，每管
最好采用全封闭式一次性微孔过滤集菌器，要求每支培养器培养装量为100ml。
3.5检查厌氧性杂菌用培养基需加热驱氧者，必须冷却到45℃以下再行接种。
3.6冻干制品按使用说明书或瓶签规定的稀释量稀释后进行无菌试验
4判定
4.1无杂菌生长判为合格（有专门规定者除外）。
4.2无菌试验发现杂菌生长，可复试。该制品量应加倍。若复试仍有同样杂 菌生长，该制品判为不合格。如为不同杂菌生长，可第二次复试，复试样品为 第一次复试量的2倍，若仍有杂菌生长该制品判为不合格。支原体阳性者不复 试，该批制品判为不合格。