大黄酚对IgA肾病大鼠肾损伤和免疫反应的调控作用

MicroＲNA 则可能参与神经系统的生理或病理过程。

miＲ－396可能参与阿尔兹海默大鼠脑内淀粉样蛋白的产生与蓄积，也可能参与神经系统肿瘤的增殖、转移及凋亡过程［16］。

本研究显示实验1组与实验2组麻醉后7d 海马组织的miＲ－96相对表达量显著高于对照组（P ＜0．05），实验2组显著高于实验1组（P ＜0．05），表明七氟醚的应用能促进miＲ－96的表达。

4
结论
综上所述，七氟醚能通过上调认知障碍大鼠海马组织miＲ－96的表达，抑制血清IGF －1的表达，从而损伤大鼠的认知功能，且七氟醚暴露8h 较暴露4h 对其损伤更明显，但具体机制尚有待进一步研究。

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（收稿日期：2018－11－09）
DOI ：10．3969/j．issn．1671－4695．2019．06．003文章编号：1671－4695（2019）06－0568－05
大黄酚对IgA 肾病大鼠肾损伤和免疫反应的调控作用
龚豪
黄丽张庆红李涛史秀岩（十堰市太和医院肾病内科湖北十堰442000）
基金项目：湖北省自然科学基金（编号：2015CFA076）
【摘要】目的探讨大黄酚对IgA 肾病大鼠肾损伤和免疫反应的影响。

方法40只大鼠随机分为4组：对照组、
大黄酚对照组（CA 组）、
IgA 肾病模型组（IgA 组）和大黄酚实验组（IgA +CA 组）。

IgA 组和IgA +CA 组自由饮溶于6mM HCl 酸化水的0．1%的牛血清球蛋白连续8周后尾静脉注射1mg 牛血清球蛋白，对照组和CA 组用生理盐水代替牛血清球蛋白进行相同处理；然后CA 组和IgA +CA 组大鼠灌胃给予溶解于0．9%的生理盐水的大黄酚［
10mg /（kg ·d ）］，对照组和IgA 组则给予生理盐水处理。

苏木素－伊红（HE ）染色观察肾脏组织病变。

运用全自动生化分析仪检测大鼠尿蛋白、血清肌酸酐和尿素氮水平。

蛋白印记分析大鼠细胞增殖核抗原－67（Ki －67）、增殖细胞核抗原（PCNA ）、Caspase －3和Caspase －9表达。

酶联免疫吸附实验检测大鼠血清中白细胞介素（IL ）－1β和IL －18水平。

结果
与对
照组相比，IgA 肾病模型组大鼠尿蛋白、血清肌酸酐和尿素氮水平升高（P ＜0．01）。

大黄酚实验组大鼠尿蛋白、血清肌酸酐和尿素氮水平低于IgA 肾病模型组（P ＜0．01）。

而且，
IgA 肾病模型组大鼠Ki67和PCNA 表达低于对照组（P ＜0．01）。

与IgA 肾病模型组相比，大黄酚实验组大鼠Ki67和PCNA 表达升高（P ＜0．01）。

与对照组相比，IgA 肾病模型组大鼠Caspase －3和Caspase －9表达增强（P ＜0．01）。

大黄酚实验组大鼠Caspase －3和Caspase －9表达低于IgA 肾病模型组（P ＜0．01）。

另外，
IgA 肾病模型组大鼠血清中IL －1β和IL －18水平高于对照组（P ＜0．01）。

与IgA 肾病模型组相比，大黄酚实验组大鼠血清中IL －1β和IL －18水平下降（P ＜0．01）。

结论大黄酚可减轻IgA 肾病大鼠的
肾损伤和炎症反应。

【关键词】大鼠
IgA 肾病
大黄酚
肾损伤
增殖
凋亡
炎症反应
Effects of chrysophanic acid on kidney injury and inflammatory response in IgA nephropathy rats．GONG Hao，HUANG Li，ZHANG Qing －hong，et al．Department of Nephrology，Shiyan Taihe Hospital，Shiyan Hubei442000，China．
【Abstract】Objective To explore the effect of chrysophanic acid on kidney injury and inflammatory response in IgA nephropathy rats．Methods Forty rats were randomly divided into four groups：control group，chrysophanic acid control group（CA），IgA nephropathy model group （IgA）and chrysophanic acid treatment group（IgA+CA）．Pathological changes of tissues were observed by hematoxylin－eosin（HE）staining．The levels of proteinuria，serum creatinine and urea nitrogen were detected by fully automatic biochemical analyser．The expression of antigen iden-tified by monoclonal antibody（Ki－67），proliferating cell nuclear antigen（PCNA），Caspase－3and Caspase－9was measured by western blot．The levels of interleukin（IL）－1βand IL－18were tested by enzyme－linked Immunosorbent assay（ELISA）．Ｒesults Compared with control group，the levels of proteinuria，serum creatinine and urea nitrogen in IgA nephropathy model group were enhanced（P＜0．01）．The levels of proteinuria，serum creatinine and urea nitrogen in chrysophanic acid treatment group were lower than IgA nephropathy model group（P＜0．01）．What＇s more，the expression of Ki67and PCNA in IgA nephropathy model group was lower than that of control group（P＜0．01）．Compared with IgA nephropathy model group，the expression of Ki67and PCNA in chrysophanic acid treatment group was elevated（P＜0．01）．Compared with the control group，the expression of Caspase－3and Caspase－9in IgA nephropathy model group was higher（P＜0．01）．The expression of Caspase－3and Caspase－9in chrysophanic acid treatment group was lower than IgA nephropathy model group（P＜0．01）．In addition，the levels of IL－1βand IL－18in IgA nephropathy model group were higher than those in the control group（P＜0．01）．Compared with IgA ne-phropathy model group，the levels of IL－1βand IL－18in chrysophanic acid treatment group were decreased（P＜0．01）．Conclusion Chry-sophanic acid alleviates the kidney injury and inflammatory response in IgA nephropathy rats．
【Key words】Ｒats；IgA nephropathy；Chrysophanic acid；Ｒenal injury；Proliferation；Apoptosis；Inflammatory response
IgA肾病是世界上最常见的肾小球疾病，也是导致肾衰竭的主要原因。

IgA肾病的常见特征包括肾功能障碍，大量的蛋白尿，炎症反应及高血压等。

目前大部分的治疗策略主要包括血压控制，血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素受体抑制剂，这些方法除了降低蛋白尿外也经常用于其他慢性肾病的治疗。

但这些方法的有效性和针对性都是有限的，专门针对IgA肾病的有效的治疗方法还十分缺乏［1－3］。

挖掘新的针对IgA肾病的有效的治疗方法迫在眉睫。

大黄酚（Chrysophanic acid，CA）是药用大黄和虎杖的主要活性物质，属于蒽醌类化合物，具有降脂，抗氧化应激，抗炎等功效［4，5］。

有研究表明大黄酚有助于癌症、抑郁症及缺血再灌注损伤的治疗［6－8］。

但对大黄酚在肾病中的治疗功效还缺乏了解，有待进一步研究。

本研究的主要目的是探索大黄酚对IgA肾病大鼠肾损伤和免疫反应的调控作用。

1材料与方法
1．1实验动物及主要试剂6周龄大鼠（清洁级SD雄性大鼠，体重200g10g）购自中国科学院实验动物中心，大黄酚（分析纯）和牛血清球蛋白购自美国Sigma公司。

苏木素－伊红（hematoxylin－eosin，HE）染色液购自上海碧云天生物技术公司。

抗细胞增殖核抗原－67（antigen identified by monoclonal antibody，Ki－67）抗体，抗增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗体，抗caspase－3抗体和抗caspase－9抗体购自英国Abcam公司。

白细胞介素－1β（interleukin，IL －1β）和IL－18的酶联免疫吸附实验（enzyme－linked Immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司。

1．2动物分组及药物处理40只大鼠随机分为4组：对照组，大黄酚对照组（CA），IgA肾病模型组（IgA）和大黄酚实验组（IgA+CA）。

IgA组和IgA+CA组自由饮溶于6mM HCl酸化水的0．1%的牛血清球蛋白连续8周，8周末尾静脉注射1mg牛血清球蛋白，连续3d。

健康对照组和对照加药组用生理盐水代替牛血清球蛋白进行相同处理。

然后CA组和IgA+CA组大鼠灌胃给予溶解于0．9%的生理盐水的大黄酚［10mg/（kg·d）］，连续7d。

对照组和IgA组则给予生理盐水处理。

1．3HE染色大黄酚处理7d后颈椎脱臼法处死大鼠后取出肾脏组织，PBS清洗后用4%的多聚甲醛在4ħ固定24h。

PBS清洗3次，再用30%、50%和70%的乙醇依次脱水10min。

去除乙醇脱水机中脱水，然后进行石蜡包埋切片。

按照HE染色液说明书进行进行HE染色。

光镜下观察组织病变情况。

1．4肾功能指标检测大黄酚处理7d后采集各组大鼠尿液，运用全自动生化分析仪检测尿蛋白。

同时收集待测大鼠血液，用全自动生化分析仪检测血清肌酸酐和血尿素氮。

1．5蛋白印记大黄酚处理7d后，颈椎脱臼法处死大鼠后取出肾脏组织，肾脏组织进行匀浆后加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行总蛋白提取，再于100ħ下变性5min。

然后等量蛋白经SDS－PAGE凝胶电泳分离后转至PVDF膜，用5%的BSA封闭1h后分别加入相应的一抗：Ki67（1︰500）、PCNA（1︰1000）、Caspase－3（1︰500）和Caspase－9（1︰500），4ħ下孵育过夜。

第二天加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1．5h。

最后加入发光液后于凝胶成像仪进行曝光拍照并统计灰度值计算相对表达量。

1．6ELISA检测收集各组大鼠血清，然后按照ELA-SA试剂盒说明书步骤进行检测。

简而言之，首先将样品加入反应孔后于37ħ孵育45min，用洗涤液洗涤4次后加入生物素标记的抗体于37ħ反应30min，洗涤后加链霉亲和素－HＲP，混匀后于37ħ反应30min，再加入显色剂避光显色15min，最后添加终止液终止反应后450nm处检测吸光值。

1．7统计学分析用SPSS16．0软件对实验数据进行统计学分析，组间比较用方差检验。

P＜0．01认为存在
统计学差异。

2结果
2．1
四组大鼠肾脏组织病变的影响通过HE 染色观
察各组大鼠肾脏组织病变发现，
IgA 肾病模型组大鼠出现肾小球增大，肾小管开裂等病变；给予大黄酚处理可
以缓解IgA 肾病大鼠的肾脏组织病变（图1）。

图1
四组大鼠肾脏组织病变情况（HE 染色ˑ400）
2．2
各组大鼠尿蛋白水平的比较检测各组大鼠的
尿蛋白的结果显示，
IgA 肾病模型组大鼠的尿蛋白含量高于对照组（t =9．617，P ＜0．001）。

与IgA 肾病
模型组相比，大黄酚实验组大鼠的尿蛋白含量下降（t =9．908，P ＜0．001）。

见表1。

表1
各组大鼠尿蛋白水平的比较
组别尿蛋白（mg /24h ）对照组5．0ʃ3．0
CA 组6．0ʃ2．0＊＊IgA 组
42．0ʃ7．0＊＊IgA +CA 组16．0ʃ5．0＊＊##
F 值136．51P 值
＜0．001
注：与对照组相比，
＊＊
P ＜0．01；与IgA 肾病模型组相比，##P ＜0．01。

2．3
四组大鼠血清肌酸酐和尿素氮水平比较分析各
组大鼠血清肌酸酐和尿素氮水平发现，
IgA 肾病模型组大鼠的血清肌酸酐和尿素氮水平高于对照组，差异
具有统计学意义（t =3．047，
P =0．007；t =5．270，P ＜0．001）。

大黄酚实验组大鼠的血清肌酸酐和尿素氮
水平低于IgA 肾病模型组，差异具有统计学意义（t =2．416，P =0．027；t =4．166，P =0．001）。

见表2。

表2四组大鼠血清肌酸酐和尿素氮水平比较
（珋x
ʃs ）组别肌酸酐（mg /dl ）尿素氮（mg /dl ）对照组0．55ʃ0．06
14．0ʃ4．0
CA 组0．49ʃ0．09＊＊12．0ʃ3．0＊＊IgA 组
1．07ʃ0．12＊＊27．0ʃ5．0＊＊IgA +CA 组0．67ʃ0．10＊＊##
18．0ʃ3．6＊＊##
F 值86．2028．00P 值
＜0．001＜0．001
注：与对照组相比，
＊＊
P ＜0．01；与IgA 肾病模型组相比，##P ＜0．01。

2．4
大黄酚对IgA 肾病大鼠细胞增殖标记蛋白表达的
影响由图2可知，
IgA 肾病模型组大鼠Ki67和PC-NA 表达水平低于对照组，差异具有统计学意义（t =
13．000，P ＜0．001；t =6．510，P ＜0．001）。

与IgA 肾病模型组相比，大黄酚实验组大鼠Ki67和PCNA 表达水
平升高，差异具有统计学意义（t =6．788，P ＜0．001；t =4．472，P ＜0．001）。

图2蛋白印记检测IgA 肾病大鼠细胞增殖标记蛋白表达
注：与对照组相比，
＊＊
P ＜0．01；与IgA 肾病模型组相比，##P ＜0．012．5
四组大鼠细胞凋亡相关蛋白表达水平比较如图
3所示，IgA 肾病模型组大鼠Caspase －3和Caspase －9表
达水平高于对照组，差异具有统计学意义（t =7．205，P
＜0．001；t =8．336，P ＜0．001）。

与IgA 肾病模型组相比，大黄酚实验组Caspase －3和Caspase －9表达水平
减弱，差异具有统计学意义（t =4．740，P ＜0．001；t =4．217，P =0．001）。

图3
蛋白印记检测大鼠细胞凋亡相关蛋白表达
注：与对照组相比，
＊＊
P ＜0．01；与IgA 肾病模型组相比，##P ＜0．012．6
大黄酚对IgA 肾病大鼠炎症因子水平的影响IgA 肾病模型组大鼠血清中IL －1β和IL －18水平高于
对照组，差异具有统计学意义（t =37．598，
P ＜0．001；t =14．430，P ＜0．001）。

与IgA 肾病模型组相比，大黄酚实验组大鼠血清中IL －1β和IL －18水平下降，差异具有统计学意义（t =9．624，P ＜0．001；t =7．001，P ＜0．001）。

见表3。

表3
四组大鼠炎症因子水平比较
（珋x
ʃs ）组别IL －1β（pg /ml ）
IL －18（pg /ml ）对照组26ʃ5
13ʃ3
CA 组21ʃ8＊＊
16ʃ5＊＊IgA 组
157ʃ16＊＊79ʃ11＊＊IgA +CA 组63ʃ9＊＊##29ʃ7＊＊##F 值372．86870．25P 值
＜0．001＜0．001
注：与对照组相比，
＊＊
P ＜0．01；与IgA 肾病模型组相比，##P ＜0．01。

3
讨论
IgA 肾病是一种高度可变的恶性疾病，总体来说约25%的患者会经历一段时间的缓解，但约30%的患者在20年内则会发展成终末期肾病［9］。

对终末期肾病患者往往需要进行肾脏移植，但移植后的复发率十分高，约
20% 60%［1］。

IgA 肾病的治疗是人类卫生医疗系统
的重大课题。

越来越多的研究表明植物提取物在疾病治疗方面发挥着积极作用。

尿蛋白作为肾损伤的一个标志，指示肾小管的重吸收不足或者过滤性损伤。

血清肌酸酐则是肾功能损伤最常用的检测指标［10］。

虽然血清肌酐上调不一定是肾小球过滤效率降低的指标，但是却与肾功能损伤紧密相关［11］。

同时大量的临床证据表明肾小球过滤效率降低和肾损伤都会造成尿素氮含量升高尿蛋白［12］。

因此，本研究主要将尿蛋白，血清肌酸酐和尿素氮作为肾功能和体现病变严重程度的主要指标。

许多植物提取物具有调节尿蛋白，血清肌酸酐和尿素氮水平的功效。

有数据显示在阿霉素诱导的肾病大鼠中，茅根提取物可减弱蛋白尿水平的升高［13］。

在缺血/再灌注肾损伤小鼠中，亚细亚蒿可降低血清肌酐和尿素氮水平［14］。

有研究显示，草莓叶提取物可抑制糖尿病肾病大鼠血清肌酐和尿素氮水平的升高［15］。

据报道来源于大黄的另一种蒽醌类物质大黄酸可降低慢性肾病大鼠中异体移植引起的血清肌酐水平的上升［16］。

本研究结果显示，在IgA肾病大鼠中，大黄酚处理可降低尿蛋白，血清肌酸酐和尿素氮水平。

增殖凋亡相关蛋白在各类疾病中发挥着重要作用，许多文献报道植物提取物可以调控增殖凋亡相关蛋白的表达。

Shin等［17］发现在庆大霉素诱导的急性肾损伤大鼠中，红参提取物可减弱Bax、Caspase－3和Caspase －9表达，抑制细胞凋亡。

有数据显示葡萄籽原花青素提取物可抑制顺铂诱导的肾毒性小鼠Caspase－12表达，减弱细胞凋亡［18］。

据报道大黄酚可降低亚硝基脲诱导的视网膜变性小鼠视网膜细胞Bax和Caspase－3表达的升高，抑制细胞凋亡［19］。

有研究发现大黄酚可减弱缺血/再灌注小鼠脑组织内质网应激介导的神经细胞凋亡，抑制CHOP和Caspase－12的表达［20］。

本研究结果显示，在IgA肾病大鼠中，大黄酚具有提高Ki67和PCNA表达，减弱Caspase－3和Caspase－9表达的功效。

Ki67和PCNA表达升高说明肾病大鼠肾脏组织中细胞增殖水平增加，而Caspase－3和Caspase－9表达下调，说明大鼠发生肾损伤导致的细胞凋亡水平降低；所以大黄酚具有保护受损肾脏组织细胞免受细胞凋亡，促进细胞增殖的作用。

许多疾病中都会出现炎症反应增强的现象，越来越多的研究表明植物提取物可以抑制炎症反应［21］。

据报道嘉宝果提取物可抑制糖尿病肾病小鼠TNF－α、IL－6和IL－1β的表达，减轻炎症反应［22］。

有数据显示水麻叶提取物可降低糖尿病引起的肾病大鼠肾脏组织IL－6、TNF－α和IL－1β水平［23］。

Zhao等［24］发现在缺血/再灌注损伤小鼠中，大黄酚可抑制TNF－α和IL－1β水平的上升。

有研究表明大黄酚还可降低百草枯诱导的肺损伤小鼠IL－1β、IL－6和TNF－α水平的升高［25］。

有研究证明，大黄酚主要的药理作用为抗炎、抗肿瘤和抗凝血等作用［4］。

本研究结果显示，在IgA肾病大鼠中，大黄酚可降低IL－1β和IL－18水平，抑制IgA 肾病大鼠炎症反应的增强。

IL－1β和IL－18降低说明肾病大鼠受损肾脏组织细胞中炎症因子表达水平下降，大黄酚可以有效地降低大鼠受损肾脏处炎症反应。

本研究结果表明，在IgA肾病大鼠中，大黄酚处理可改善肾脏组织病变，降低尿蛋白，血清肌酸酐和尿素氮水平；提高Ki67和PCNA表达，减弱Caspase－3和Caspase－9表达；降低IL－1β和IL－18水平。

4结论
综上所述，大黄酚具有减轻IgA肾病大鼠肾损伤和炎症反应的功效。

但是受到研究方法和研究篇幅的影响，尚需要进一步对大黄酚在大鼠及其他动物模型体内以及临床应用中相关药理学和药代动力学进行研究。

本研究下一步计划研究大黄酚在其他肾病模型中的肾脏保护作用，为挖掘新的有效的肾病治疗药物提供理论依据。

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（收稿日期：2018－11－06）
DOI ：10．3969/j．issn．1671－4695．2019．06．004文章编号：1671－4695（2019）06－0572－05
氯沙坦对百草枯中毒致大鼠肺损伤的改善作用及与ACE2/Ang －（l －7）/Mas 受体轴表达的关系
何诚
陶宁胡建平（遂宁市中心医院急诊科四川遂宁629000）
基金项目：重庆市科卫联合医学科研项目（编号：2018NXM040）
【摘要】目的分析氯沙坦对百草枯中毒致大鼠肺损伤的改善作用及与ACE2/Ang －（1－7）/Mas 受体轴表达的
关系。

方法将36只清洁级雄性SD 大鼠随机分为对照组、模型组和实验组，三组各12只。

对照组给予生理盐水；模型组给予百草枯溶液18mg /kg ，于一次性腹腔注射；实验组给予百草枯溶液18mg /kg ，于一次性腹腔注射，待0．5h 后应用
氯沙坦溶液进行灌胃，每日10mg /kg 。

1周、2周、3周取各组大鼠肺组织，对其肺系数进行计算以评估其肺水肿的状况；
采用HE 染色对各组大鼠肺泡炎的程度进行观察，并用Masson 染色评估大鼠肺纤维化的严重程度；采用酶联免疫吸附试验法检测各组大鼠肺组织匀浆中Ang －（1－7）和转化生长因子β1（TGF －β1）的水平，并通过免疫组织化学法对各组
大鼠肺组织中Mas 受体和血管紧张素转换酶II （ACE2）蛋白的表达水平进行检测。

结果在染毒后1周、
2周、3周时，模型组和实验组肺系数较对照组均显著升高（P ＜0．01），
而实验组各时间点时的肺系数较模型组均显著下降（P ＜0．01）。

在染毒后1周、2周、3周，模型组出现明显肺泡炎症，且随着染毒时间的增加，可出现肺纤维化，实验组肺泡炎
症程度轻于模型组，实验组肺纤维化程度较模型组明显减轻。

随着染毒时间的增加，
Ang －（1－7）和TGF －β1在模型组与实验组肺组织匀浆中的水平均逐渐升高，且模型组与实验组各时间点Ang －（1－7）和TGF －β1的含量较对照组均
显著升高（P ＜0．01）；染毒后1、
2、3周，Ang －（1－7）在实验组肺组织匀浆中的水平较模型组明显升高，而TGF －β1的含量较模型组显著下降（P ＜0．01）。

随着染毒时间的增加，模型组与实验组大鼠肺组织中Mas 受体和ACE2蛋白的表
达水平均显著升高（P ＜0．05），
且实验组染毒后2周、3周Mas 受体和ACE2蛋白的表达水平较模型组均显著升高（P ＜0．05）。

结论在百草枯中毒后，肺组织匀浆中Ang －（1－7）和TGF －β1的表达水平明显上调，而氯沙坦可能通过升高ACE2/Ang －（1－7）/Mas 受体轴的表达水平而起到下调纤维化因子TGF －β1表达的作用，因此可改善百草枯中毒所引起的肺损伤和肺纤维化的形成。

【关键词】大鼠百草枯肺损伤肺纤维化氯沙坦ACE2Ang －（1－7）TGF －β1Mas 受体
Improvement of lung injury induced by paraquat poisoning by losartan and its relationship with expression of ACE 2/Ang －（l －7）/Mas receptor axis．HE Cheng ，TAO Ning ，HU Jian －ping．Department of Emergency ，Suining Central Hospital ，Suining Sichuan 629000，China．
【Abstract 】Objective
To analyze the effect of losartan on lung injury induced by paraquat poisoning and its relationship with the expression
of ACE2/Ang －（l －7）/Mas receptor axis．Methods 36male SD rats of clean grade were randomly divided into control group ，model group and ex-perimental group with 12rats in each group．The control group was given normal saline ；the model group was given paraquat solution 18mg /kg ，once。