壳聚糖对黄芩水提液净化除杂工艺的研究

壳聚糖对黄芩水提液净化除杂工艺的
研究
【摘要】目的筛选壳聚糖对黄芩水提液的最佳纯化工艺，从而优化黄芩苷的提取工艺。

方法以黄芩苷得重（得重= 粗品黄芩苷重量×黄芩苷浓度）为衡量指标，运用正交实验考察不同影响因素对絮凝效果的影响，同时采用HPLC测定其含量对工艺进行系统评价。

结果壳聚糖对黄芩水提液絮凝的最佳工艺条件：体系
pH5，搅拌时间10 min，体系温度40℃，絮凝剂浓度0.5%。

结论壳聚糖对黄芩水
提液具有较强的絮凝作用，该方法简单可行，可提高黄芩药材的利用率。

【关键词】壳聚糖；黄芩苷；水提液；絮凝剂
黄芩Scutcnana Baicalensis Georgi为唇形科植物黄芩的干燥根［1］，主要功效为清热燥湿、泻火解毒、止血安胎。

黄芩中主要成分为黄酮类化合物，其中含量较高的有效成分有黄芩苷(Baicalin)、汉黄芩苷(Wogonoside)、黄芩素(Baicalein)、汉黄芩素(Wogonin)等。

目前代谢研究表明，黄芩苷和汉黄芩苷为前药，黄芩素和汉黄芩素为二者的真正药效物质基础。

药理学研究表明，黄芩具有多种药理作用，如抗菌、抗病毒、抗炎、抗变态反应、抗氧化、清除氧自由基、抗癌、抗肿瘤、抗凝、抗血栓形成和保护肝脏、心脑血管、神经元等作用，目前临床主要用于抗炎和抗菌。

在现代中药生产中，经常使用酸沉法从中药黄芩中提取粗品黄芩苷来代替黄芩。

但在黄芩水提液的酸沉过程中，水提液中的一些有机大分子杂质如淀粉、果胶、蛋白质等会随有效成分一起沉降下来，这就造成粗品黄芩苷中含有许多无效成分，降低了疗效。

如果用传统的纯化工艺，黄芩苷的得率又得不到保证，进而造成了原药材的大量浪费。

壳聚糖作为长链高分子碱性多糖，在稀酸中可形成活性基团-NH3+，对溶液中带负电荷的成分如蛋白质、树胶、鞣质、单宁、部分多糖等［2］进行吸附，从而达到对黄芩水提液净化除杂的作用，在保证产量的前提下实现提高黄芩苷含量的目的。

1 仪器与试剂
1.1 仪器
LC-20AT 型HPLC（岛津公司）；88-1型定时恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；中速自动平衡微型离心机（北京医用离心机厂）；ZK-82型真空干燥箱（上海市实验仪器总厂）；德国Sartorius BS224S电子天平；METTLER AE240
电子分析天平（瑞士）及实验过程所需的玻璃仪器。

1.2 试剂壳聚糖（济南海得贝生物公司）；甲醇（色谱纯）；双重蒸馏水;其他试剂均为分析纯。

2 方法
2.1 壳聚糖絮凝剂的配制用1%的乙酸为溶剂，分别配制浓度为0.5%，1.0%，1.5%的壳聚糖溶液，充分溶胀后作为絮凝剂，备用。

2.2 黄芩水提液的制备筛选合格的黄芩干燥根，蒸透后切片。

称取黄芩饮片100 g，分别加10倍，8倍量水煎煮2次，1 h/次，纱布过滤，合并两次滤液，平分4份，待用。

2.3 黄芩苷粗品的制备［3］黄芩水提液→加入壳聚糖→静置过夜→离心→上清液水浴加热至40℃→盐酸调pH1.5→40℃恒温1 h→静置过夜→倾去上清液→沉淀水洗至pH 6→减压抽滤→60℃真空干燥→即得。

2.4 单因素实验分别以体系温度、体系pH、搅拌时间、壳聚糖用量以及壳聚糖的浓度为考察因素，在不同水平下进行单因素实验，以期筛选出影响絮凝效果的主要因素和水平。

从而为正交实验设计提供依据。

2.5 黄芩苷含量测定方法学考察
2.5.1 色谱条件色谱柱：Hypersil ODS C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm，大连伊利特）；检测器：SPD-20 A (SHIMADZU)；工作站：CS-Light；流动相：甲醇－0.4%磷酸水溶液(47 ∶53)；柱温：35℃ ；流速：1 ml/min；检测波长：278 nm。

2.5.2 对照品溶液的制备取黄芩苷1.67 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加少量甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

2.5.3 供试品的制备称取黄芩苷样品适量，精密称定，置于5 ml量瓶内，加少量甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

2.5.4 标准曲线的绘制分别取黄芩苷（0.167 mg/ml）标准品溶液2，4，6，8，10，12 μl，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得到黄芩苷回归方程：Y= 565 266.1X+69 456.9，R=0.999 7，说明黄芩苷在0.334 ～2.004 μg范围内线性关系良好。

2.5.5 精密度实验精密吸取同一供试品溶液10 μl，连续进样5次，记录色谱图。

测得各共有峰的相对峰面积RSD小于3％，相对保留时间RSD小于1％。

表明仪器精密度良好。

2.5.6 稳定性实验取同一供试品溶液，分别于0，2，8，16，24 h测定，记录色谱图。

结果表明供试品溶液在24 h内稳定，RSD小于1.5%。

2.5.7 重复性实验取同一样品5份，按供试品溶液制备方法进行制备，分别进样，记录色谱图。

测得各共有峰相对峰面积的RSD小于3％，相对保留时间的RSD小于1％。

结果表明实验重复性良好。

2.6 正交实验根据单因素实验结果，采用正交试验法优化实验操作条件，选择L9 （3）4正交实验表，分别以pH值（A）、搅拌时间（B）、温度（C）、絮凝剂浓度（D），作为实验因素各设置3个水平，对絮凝条件进行考察。

结果见表1。

表1 正交实验因素水平（略）
3 结果
3.1 搅拌时间对絮凝作用的影响黄芩水提液在自身pH和60℃条件下，随机取3份黄芩水提液加入1.0%的壳聚糖溶液25 ml后，继续用搅拌器分别搅拌10，30，50 min。

再按黄芩苷粗品的工艺流程操作。

测其得重依次为：0.967 0，0.847 4， 0.629 7。

由测定结果可知，在搅拌10 min后其得重最大。

3.2 体系pH对絮凝作用的影响随机取3份黄芩水提液，体系在60℃条件下分别调节pH至5，6，7。

加入1.0%的壳聚糖溶液25 ml并搅拌30 min，再按黄芩苷粗品的工艺流程操作。

测其得重依次为：1.374 6，0.674 7，0.313 0 g。

由测定结果可知，当体系pH为5即在自身pH条件下其得重最大，但如果体系pH过低会使黄芩苷大量析出，影响粗品黄芩苷重量。

3.3 体系温度对絮凝作用的影响随机取3份黄芩水提液，在自身pH条件下恒温水浴中分别加热至40，50，60℃。

加入1.0%的壳聚糖溶液25 ml并搅拌30 min，再按黄芩苷粗品的工艺流程操作。

测其得重依次为：0.544 2，0.569 9，
0.427 6 g。

由测定结果可知，当体系温度在50℃时其得重最大。

3.4 絮凝剂浓度对絮凝作用的影响随机取3份黄芩水提液，在自身pH和60℃条件下分别加入0.5％，1.0％，1.5％的壳聚糖溶液25 ml并搅拌30 min，再按黄芩苷粗品的工艺流程操作。

测其得重依次为：1.196 3，0.990 2，0.967 8 g。

由测定结果可知，用0.5％的壳聚糖溶液作絮凝剂时其得重最大。

3.5 絮凝剂用量对絮凝作用的影响随机取3份黄芩水提液，在自身pH和60℃条件下分别加入1.0%的壳聚糖15，25，35 ml并搅拌30 min，再按黄芩苷粗品的工艺流程操作。

测其得重依次为：1.177 1，1.091 7，1.090 7 g。

由测定结果可知，加入15 ml 1.0%的壳聚糖作絮凝剂时其得重最大。

但其得重的变化率低于其他因素得重的变化率，相对于上述4个因素而言，壳聚糖用量对絮凝作用的影响可以忽略，可以不作为主要影响因素考察。

3.6 正交实验结果与分析见表2～3。

表2 正交实验结果与分析（略）表3 实验结果方差分析（略）
由表2～3可知，搅拌时间的极差最大，其次是体系pH，故对黄芩水提液絮凝效果影响的大小顺序为B>A>D>C，最佳絮凝条件为A1B1C1D1，即体系pH 5，
搅拌时间10 min，体系温度40℃，絮凝剂浓度0.5%。

3.7 最佳方案的验证实验以正交表所得出的最佳絮凝条件为工艺条件，取黄芩饮片25 g，按黄芩苷粗品的工艺流程操作。

重复两次。

结果见表4。

表4 验
证实验结果（略）
由表4 可知，采用优化的最佳工艺对黄芩水提液进行除杂后，其黄芩苷
得重显著增高，且工艺条件稳定可靠。

4 讨论与结论
实验表明，在保证得率的前提下，壳聚糖对黄芩水提液有较好的絮凝净化作用，而且絮凝作用具有良好的选择性。

本实验在综合考虑各种因素的影响后，最终确定了絮凝的最佳工艺条件：体系pH=5，搅拌时间10 min，体系温度40℃，絮凝剂浓度0.5%。

本实验在克服传统酸沉法不能兼顾得率与含量的缺点的基础上，
采用絮凝法进行除杂，取得良好的预期效果，得重较高，有效地减少有效成分的损失，并且工艺简单，提高了原药料的利用率。

壳聚糖属于一种高分子聚合物，絮凝是通过长碳链上的一些活性官能团，可在同一个分子上吸附多个微粒。

因而它在微粒之间产生了联系作用，这种作用称之为架桥作用。

由于这种作用，可以将许多微粒连接在一起形成一个絮团［2］。

絮凝是一个复杂的化学动力学过程。

搅拌和pH对絮凝效果有显著的影响，原因可能是：当搅拌不充分时，会导致加入的壳聚糖局部浓度过高，使壳聚糖不能及时充分地与微粒相结合，反而被先形成的絮团所包容而沉淀出来，这种沉淀下来的絮团的动力学常数相当稳定，一般的搅拌方式不能有效地一一对其进行完全的破环。

这就大大降低了壳聚糖的利用率。

同时如果在较低的pH条件下，更有利于壳聚糖分子中的活性基团-NH3+的形成，使絮凝作用进行得更完全。

参考文献
1］国家药典委员会．中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：211.
［2］董方言．现代实用中药新剂型新技术［M］.北京：人民卫生出版社，2001．
［3］冀春茹.中药化学实验技术与实验［M］.郑州：河南科学技术出版社，1986：273.。