表达单克隆抗体的CHO细胞无蛋白培养基的优化_刘国庆

2013 年 2 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Feb. 2013文章编号：1003-9015(2013)01-0096-06
表达单克隆抗体的CHO细胞无蛋白培养基的优化
刘国庆, 陈飞, 赵亮, 范里, 谭文松
(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室, 上海 200237)
摘要：在自主研发无蛋白培养基的基础上，考察了氨基酸、维生素和葡萄糖对CHO细胞生长、代谢与抗体合成的
影响。

结果表明，对培养过程中消耗较多的氨基酸进行补充，虽然不能促进细胞生长，但有利于培养后期细胞活性维
持与抗体合成；B族维生素的添加能促进细胞生长并延长培养时间；作为重要的碳源和能源，葡萄糖浓度较高时会抑
制细胞生长，而浓度较低时不能有效支持细胞生长与抗体合成，维持其在适当浓度有利于细胞生长并能延长培养时间，从而有利于提高抗体产量。

通过合理调整各营养物的浓度配比形成了优化的无蛋白培养基，CHO细胞在该培养基中的
最高密度达到52.6×105 cells⋅mL−1，抗体产量达到274 mg⋅L−1，与初始培养基相比分别提高了33%和63%。

总之，在细
胞培养过程中应维持充足且平衡的营养物成分，以有效供应细胞生长与抗体合成的需求。

关键词：CHO细胞；单克隆抗体；无蛋白培养基；优化
中图分类号：Q813.1 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-9015.2013.01.016 Optimization of Protein-free Culture Medium for CHO Cells Producing
Monoclonal Antibody
LIU Guo-qing, CHEN Fei, ZHAO Liang, FAN Li, TAN Wen-song
(State Key Lab of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology,
Shanghai 200237, China)
Abstract:Based on a protein-free culture medium with independent intellectual property rights owned by our lab, the effects of amino acids, vitamins and glucose on cell growth, metabolism and antibody production were investigated. It was found that supplementation of those most consumed amino acids promotes cell viability and antibody production in the later stage, however the supplementation doesn’t promote the cell growth and the cell concentration remains unchanged. The reasonable addition of some B vitamins improves cell growth and extends culture duration. As an important carbon and energy source, high concentration of glucose inhibits cell growth, while low concentration will be inefficient to support the cell growth and antibody production. It was demonstrated that by maintaining the glucose concentration in an optimal range, cell growth is improved and culture duration is prolonged, which are favorable for antibody production. By optimizing the fractions of nutrient components in the basal culture medium, an optimal protein-free culture medium for CHO cells was developed. The maximum viable cell concentration and antibody productivity in that medium are 52.6×105 cells⋅mL−1 and 274 mg⋅L−1, respectively, which represent an increase of 33% and 63% in comparison with those in basal culture medium. In brief, the nutrients in culture medium should be sufficient and balanced for cell growth and antibody production.
Key words: CHO cells; monoclonal antibody; protein-free culture medium; optimization
1前言
CHO细胞在生物制药产业中应用广泛，是生产抗体的首选宿主[1,2]。

单克隆抗体在相关疾病的治疗方面具有重要的价值，而抗体类药物临床使用剂量大和动物细胞表达抗体能力低的矛盾限制了抗体类药物
收稿日期：2011-06-09；修订日期：2011-10-28。

基金项目：国家自然科学基金(21106045)；国家863计划项目(2012AA02A303; 2010AA022905)；上海高校青年教师培养资助计划(hlg11011)。

作者简介：刘国庆(1987-)，男，安徽安庆人，华东理工大学硕士生。

通讯联系人：赵亮，E-mail：zhaoliang@
的运用，因此如何通过动物细胞培养技术提高抗体产量一直是研究的热点。

动物细胞体外培养所需的营养成分复杂(包括碳源、氮源、无机盐、维生素和生长因子等)且需求量大，培养基的优化是提高培养过程抗体产量的最重要手段之一。

传统的无血清培养基一般在基础培养基中添加替代血清作用的蛋白类物质，如胰岛素、转铁蛋白与白蛋白等。

蛋白类物质的添加不仅存在引入动物性污染源的风险，还不利于产品的分离纯化，并且成本较高。

近年来，研究者针对CHO 、杂交瘤等细胞系成功开发了无蛋白培养基，并在此基础上通过培养基与过程优化显著提高了抗体产量[3,4]。

由于不同细胞株之间存在差异，而且在无蛋白培养条件下细胞对营养成分的要求更高[5]，针对特定的CHO 细胞无蛋白培养基的优化是其成功迈向产业化过程中一项必不可少的工作。

本文以表达一种单克隆抗体的CHO 细胞为研究对象，以自主研发的无蛋白培养基PF1为基础，通过优化氨基酸、维生素以及葡萄糖的添加，促进细胞生长与抗体合成，旨在提高抗体的产量。

2 材料与方法
2.1 细胞株
采用DHFR 系统表达单克隆抗体的重组CHO 细胞，由军事医学科学院提供。

2.2 培养基
PF1培养基是在DMEM/F12 (1:1)(GIBCO ，USA)的基础上，通过优化血清替代物(孕酮、乙醇胺、脂类等)与蛋白(胰岛素、转铁蛋白)替代物的添加而开发的具有自主知识产权的无蛋白培养基，能够支持CHO
细胞生长与单克隆抗体的表达。

本文根据需要，在PF1培养基的基础上对营养物成分进行调整，在摇瓶中分别进行3批共7个细胞培养实验，见表1。

氨基酸、维生素和葡萄糖购自Sigma 公司。

2.3 细胞培养
摇瓶培养：将细胞以(3~4)×105 cells ⋅mL −1的密度接种于摇瓶，置于36.8℃、5% CO 2以及饱和湿度的培养箱中培养，摇床转速为50 r ⋅min −1。

反应器培养：将细胞以(3~4)×105 cells ⋅mL −1的密度接种于2 L 反应器(Biorea-2000，上海伯瑞生物技术发展有限公司)，pH 控制为 7.0 ± 0.2， DO(溶解氧浓度)控制为50%空气饱和度，温度为36.8℃，搅拌转速为80 r ⋅min −1，通气量为0.01 vvm 。

2.4 分析方法
2.4.1 细胞计数与生化分析
细胞计数与葡萄糖、乳酸、氨基酸的测定方法同文献[11]。

2.4.2 抗体浓度测定
使用Protein A 亲和层析柱纯化并收集抗体，使用高效亲和凝胶色谱法检测纯化后的抗体浓度。

2.4.3 葡萄糖比消耗速率、乳酸比生成速率和抗体比生成速率的计算
物质比消耗速率或比生成速率的计算方法相似，以抗体比生成速率为例，通过以下公式计算： Antibody P
q IVCC
Δ=
Δ
q Antibody 为抗体的比生成速率(mg·(109 cells ⋅day) −1)，代表了宿主细胞的抗体表达水平；ΔP 为一段时间
内抗体浓度的增量(mg ⋅L −1)；ΔIVCC 为一段时间内活细胞密度对时间的积分(109 cells ⋅day ⋅L −1)。

3 结果与讨论
3.1 补充氨基酸对抗体表达的影响
根据2 L 反应器中批培养的结果(图1)，CHO 细胞在PF1培养基中培养至4~5天时细胞比生长速率
表1 不同实验中的培养基组成
Table 1 The culture medium components in different experiments
S1 S2 S3
CC1C1CC2C2 C3 C4 C5 A mino acids + + + + + + B Vitamins + + + +
Glucose / mmol ⋅L −1
40 4040 40 17.5 60 17.5+20+20Notes: “+” indicates nutrients supplementation. Amino acids were supplemented
according to the consumption, and vitamins concentration was doubled according to the DMEM/F12 formula.
接近于零，细胞生长从对数期进入稳定期，最大活细胞密度达到39.5×105 cells ⋅mL −1。

培养上清液中的抗体浓度在培养过程中逐渐累积，最终浓度为168 mg ⋅L −1。

经分析PF1培养基中氨基酸的消耗情况表明(图2)，谷氨酰胺(Gln)与胱氨酸(Cys2)在培养初期迅速消耗，接近第3天时其浓度均不足初始的10%。

其他消耗比例较大的氨基酸主要有组氨酸(His)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、甲硫氨酸(Met)、亮氨酸(Ile)、异亮氨酸(Leu)与赖氨酸(Lys)，在培养至稳定期时其浓度均小于初始的40%，其它氨基酸消耗微量甚至有所生成。

部分氨基酸供应不足且不平衡可能是限制细胞进一步扩增的原因。

根据消耗情况，在第一批摇瓶实验(S1)中补充谷氨酰胺(550 mg ⋅L −1
)、苏氨酸(410 mg ⋅L −1
)、胱氨酸(40 mg ⋅L −1
)、亮氨酸(180 mg ⋅L −1)和组氨酸(60 mg ⋅L −1)，保证其对细胞生长不构成限制。

与对照(CC1)相比，氨基酸的添加(C1)对细胞生长无显著影响，最高活细胞密度均在 35.0×105 cells ⋅mL −1左右，但在一定程度上延缓了培养后期细胞的衰亡。

在培养前期(1~4 day)抗体表达情况基本一致，氨基酸的添加促进了培养后期(5~10 day)抗体的表达，最终抗体浓度达到 196 mg ⋅L −1，与对照相比提高了 25%，见图3。

氨基酸是重要的营养物质，其主要用于蛋白质、核酸和酯类等物质的合成，同时也用于代谢产生能量。

deZengotita
等[6]指出氨基酸除了作为营养物之外，还能够在培养环境恶化时对细胞起到保护作用。

在营养物耗竭或渗透压升高的情况下，氨基酸可能作为细胞存活的信号[7]或者作为有机渗透物保持细胞内酶和RNA 等分子的稳定性[8]。

S1实验中氨基酸的添加延缓了培养后期细胞的衰亡，在一定程度上维持了细胞的生理状态，有利于细胞合成与分泌抗体。

代谢分析的结果显示氨基酸的添加促进了细胞对葡萄糖的利用，葡萄糖进入TCA 循环的速率提高了40%，能量的生成更加迅速，对抗体的合成起到促进作用。

3.2 维生素对细胞生长、代谢以及抗体表达的影响
S1实验根据氨基酸消耗情况对其进行相应的补充，但细
胞密度没有明显的提高，说明此时氨基酸不是限制细胞生长的唯一因素。

根据S1实验补充氨基酸，并适当添加3种B 族维生素(4.04 mg ⋅L −1烟酰胺、
4.48 mg ⋅L −1泛酸钙与17.96 mg ⋅L −1氯化胆碱)，进行第二批摇瓶实验(S2)，考察维生素对细胞生长、代谢和抗体表达的影响。

结果发现B 族维生素的添加(C2)能够有效促进CHO 细胞的生长并延长培养时间，见图4。

细胞密度的提高与培养时间的延长有利于抗体的累积，
Time / day
A n t i b o d y c o n c e n t r a t i o n / m g ⋅L −1
图3 添加氨基酸对抗体表达的影响 Fig.3 Effect of supplementing amino acids
on the production of antibody
Time / day
图4 添加维生素对细胞生长的影响 Fig.4 Effect of supplementing vitamins on
cell growth
C e l l c o n c e n t r a t i o n / 105 c e l l s ⋅m L −1
A n t i b o d y c o n c e n t r a t i o n / m g ⋅L −1
图1 细胞在PF1培养基中批培养的生长与抗体表达
Fig.1 Cell growth and antibody production in batch in PF1 medium
Tim e / day
40
80
120
160200
240A s p G l u G l y G l n H i s T h r A r g A l a P r o T y r C y s 2V a l M e t I l e L e u L y s P h e T r p 0
204060
80
100
120140160
A m i n o a c i d r e s i d u a l s / %
图2 在PF1培养基中批培养的氨基酸消耗
Fig.2 Consumption of amino acids in batch in PF1 medium
C e l l c o n c e n t r a t i o n ⋅L −1
A s p
G l u G l y G l n H i s T h r A r g A l a P r o T y r C y s 2 V a l M e t I l e L e u L y s P h e T r p
最终抗体浓度达到237 mg ⋅L −1，与对照(CC2)相比提高了53%。

如图5所示，维生素的添加对培养前期(1~4天)葡萄糖的代谢无显著影响(葡萄糖的消耗、乳酸的生成均与对照基本一致)，但改善了培养后期(5~12 天)葡萄糖的代谢，减少了乳酸的生成，使葡萄糖更多进入TCA 循环进行代谢，从而更有效的生成能量，有利于细胞生长与培养后期细胞活性的维持。

维生素在培养基中虽然微量存在，但对细胞的生长代谢起着重要的调控作用。

B 族维生素能够促进营养物质代谢产生能量，并参与DNA 合成与修复，保持基因组的稳定性，一些研究[9,10]指出B 族维生素能够有效抑制细胞的快速凋亡。

S2实验通过B 族维生素的添加提高了细胞密度、延长了培养时间，说明维生素是细胞生长与存活的一个限制性因素，在后续的优化过程中值得进一步研究。

3.3 葡萄糖对细胞生长、代谢与抗体表达的影响
葡萄糖作为重要的碳源与能源物质，其在培养基中的浓度水平对细胞培养过程有显著影响。

前两批摇瓶实验(S1与S2)培养基中的初始葡萄糖浓度均为40 mmol ⋅L −1，随着细胞密度的提高和培养时间的延长，在培养末期葡萄糖浓度接近于零(C2)。

根据上述情况，通过第三批摇瓶实验(S3)考察不同葡萄糖浓度对细胞生长与抗体合成的影响，为无蛋白培养基的进一步优化与后续过程开发中葡萄糖浓度的控制提供依据。

如图6所示，当初始葡萄糖浓度为60 mmol ⋅L −1时(C4)，细胞生长受到一定程度的抑制，最高活细胞密度仅为26.9×105 cells ⋅mL −1。

初始葡萄糖浓度为17.5 mmol ⋅L −1时(C3)，细胞生长较快，但细胞密度达到最高(37.1×105 cells ⋅mL −1)后迅速下降，分析发现此时葡萄糖已经耗竭。

在17.5 mmol ⋅L −1初始葡萄糖浓度的基础上，于培养第3天与第6天分别添加20 mmol ⋅L −1的葡萄糖(C5)，培养过程中葡萄糖浓度维持在5~30 mmol ⋅L −1，最高活细胞密度达到46.4×105 cells ⋅mL −1。

从图7可知，初始葡萄糖浓度的不同对葡萄糖比消耗速率和乳酸比生成速率无显著影响。

在对数期葡萄糖均迅速消耗，乳酸迅速累积，C3、C4与C5的最高乳酸浓度均为25 mmol ⋅L −1左右。

进入稳定期后乳酸比生成速率均接近于零甚至为负值，乳酸的消耗说明此时葡萄糖通过糖酵解途径代谢生成乳酸的速率小于细胞通过TCA 循环利用乳酸的速率。

另外，葡萄糖代谢速率的降低说明细胞的代谢活性出现了下降，可能不利于细胞生长与抗体合成。

在对数期，葡萄糖浓度的不同对抗体的表达无显著
Time / day
010
20
30
40G l u c o s e c o n c e n t r a t i o n / m m o l ⋅L −1
L a c t a t e c o n c e n t r a t i o n / m m o l ⋅L −1
图5 添加维生素对葡萄糖代谢的影响 Fig.5 Effect of supplementing vitamins on glucose
metabolism
Time / day
C e l l c o n c e n t r a t i o n / 105
c e l l s ⋅m L −1
图6 不同葡萄糖浓度对细胞生长的影响
Fig.6 Effects of different glucose concentrations on cell growth
24
68
Time / day
(A)
S p e c i f i c g l u c o s e c o n s u m p t i o n r a t e
/ m m o l ⋅(10
9c e l l s ⋅d a y )−1
-2024681012
Time / day
(B)S p e c i f i c l a c t a t e p r o d u c t i o n r a t e / m m o l ⋅(109c e l l s ⋅d a y )−1
图7 不同葡萄糖浓度对葡萄糖比消耗速率(A)与乳酸比生成速率(B)的影响
Fig.7 Effects of different glucose concentrations on specific rates of glucose(A) and lactate(B)
影响，抗体比生成速率均在12.26~13.31 mg·(109 cells ⋅day)−1之间。

当葡萄糖耗竭时(C3)，抗体比生成速率明显下降，而在葡萄糖充足的情况下(C4、C5)，随着细胞生长进入稳定期抗体比生成速率也有所下降，并且C5与C4比相对较低，见图8。

但细胞密度高(C5)有利于抗体的累积，C5的最终抗体浓度分别为C3与C4的2.75和1.47倍。

在高糖浓度下(C4)细胞生长受到抑制，而在实验范围内初始葡萄糖浓度的不同对其代谢无显著影响，并且最高的乳酸浓度相当，说明此时乳酸不是限制细胞生长的主要因素。

对出现此现象的原因尚有待研究，但仅从
培养基优化的角度来说，在培养初期维持相对较低的葡萄糖浓度明显有利于细胞的生长。

在葡萄糖充足的情况下(C4与C5)，抗体比生成速率在进入稳定期后也有一定程度下降，并且细胞密度越高时(C5)这种下降趋势越明显。

在批培养过程中随着营养物的消耗与代谢活性的降低，细胞生长与抗体合成均受到物质与能量的限制[11,12]，并且两者之间可能存在一定的矛盾关系。

3.4 无蛋白培养基的优化
根据三批摇瓶实验(S1、S2与S3)的结果对无蛋白培养基进行优化，并通过2 L 反应器进行验证。

根据氨基酸消耗情况分别补充组氨酸(60 mg ⋅L −1)、苏氨酸(410 mg ⋅L −1)、酪氨酸(111 mg ⋅L −1)、胱氨酸(40 mg ⋅L −1)、甲硫氨酸(34 mg ⋅L −1)、亮氨酸(180 mg ⋅L −1)和谷氨酰胺(550 mg ⋅L −1)，并添加烟酰胺(4.04 mg ⋅L −1)、泛酸钙(4.48 mg ⋅L −1)与氯化胆碱(17.96 mg ⋅L −1)。

另外，在培养过程中使葡萄糖浓度维持在10~20 mmol ⋅L −1。

结果在2 L 生物反应器中细胞密度达到52.6×105 cells ⋅L −1，最终抗体浓度为274 mg ⋅L −1。

在对数期与稳定期抗体平均比生成速率分别为11.09和6.94 mg ⋅(109 cells ⋅day)−1。

比较优化培养基前后的2 L 反应器培养结果，最高细胞密度与抗体产量分别提高了33%与63%。

对于表达重组蛋白的哺乳动物细胞而言，培养基的优化是提高产量的有效手段。

Altamirano 等[5] 在一种无血清、低蛋白培养基的基础上研究发现维生素的添加有利于CHO 细胞生长，对重组蛋白的比生成速率则没有显著影响；胆固醇与脂肪酸有利于维持细胞膜的稳定与细胞的活性，但不利于重组蛋白的分泌；氨基酸的补充能够促进蛋白的合成，提高比生产速率。

作者通过系统的优化维生素、胆固醇、脂肪酸与特定氨基酸的添加，使CHO 细胞密度与重组蛋白产量分别提高了约100%与80%。

尽管在不同研究中使用的细胞株来源及其构建存在诸多差异，但在基础培养基中合理添加各类营养物均能在不同程度上促进细胞生长与产物合成。

4 结 论
无蛋白培养基是目前细胞培养基的一个发展趋势，具有良好的应用前景。

本文在自主研发无蛋白培养基PF1的基础上，通过摇瓶实验考察3类主要营养物质(氨基酸、维生素和葡萄糖)对细胞生长、代谢与抗体合成的影响，结果表明：(1)对一些消耗较快的氨基酸的补充有利于培养后期细胞活性的维持与抗体合成；(2)B 族维生素的适当添加有利于细胞的生长和培养时间的延长，并能改善葡萄糖的代谢，使之更有效地生成能量；(3)葡萄糖作为主要的碳源与能源物质，在培养过程中应维持在一定浓度范围内，使其在提供细胞生长与抗体合成所必需的物质与能量的同时不会抑制细胞的生长。

根据摇瓶实验的结果调整PF1培养基中主要营养物葡萄糖、氨基酸、维生素的浓度配比，使2 L 反应器中的最高细胞密度与抗体产量分别提高了33%与63%，但在培养过程中抗体比生成速率仍呈下降趋势。

此无蛋白培养基尚有优化的空间，实验中发现的氨基酸与维生素等有效成分及其作用机制值得进一步研究，以使得能在提高细胞密度的同时，保证抗体比生成速率和提高抗体产量。

C3C4C5
48121620
图8 抗体比生成速率的变化
Fig.8 Change of the specific antibody production rates
S p e c i f i c a n t i b o d y p r o d u c t i o n r a t e
/ m g ⋅(109 c e l l s ⋅d a y )−1
exponential phase stationary phase and after
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