甘草黄酮对辣椒素诱导豚鼠咳嗽反射的抑制作用

(P<0101),但未达到正常水平(P<0105);0101～10Λm o l L前荷叶碱能明显减少细胞凋亡的发生,与A ng 组相比差异有显著性(P<0105),以1Λm o l L作用最强(P<0101),但与空白对照组相比均未能达到正常水平(P<0105)。

4　讨论
A ng 是肾素2血管紧张素2醛固酮(RA S)系统中主要的生物活性物质,是强有力的血管收缩剂,在血管内外平衡、内膜的形成及心肌梗死后的重塑中有重要的作用,可刺激活性氧(RO S)的产生,诱导血管内皮细胞发生凋亡[3]。

而血管内皮细胞凋亡是动脉粥样硬化等多种心血管疾病发生的始动环节。

A ng 在体内能上调黏附分子表达,激活巨噬细胞趋化因子和纤溶酶原活化因子抑制剂21(PA I21),促进平滑肌细胞的增殖和迁移,促使内皮功能失调。

它通过促进DNA的氧化,使Ser15和Ser20磷酸化,从而激活p53,同时激活NAD PH氧化酶,产生大量自由基而触发凋亡[4]。

血管紧张素转换酶抑制剂(A CE I)卡托普利、依那普利等通过增强eNO S 的活性,增加NO的生成,抑制casp ase级联反应,以及恢复和稳定eNO S与热休克蛋白90(H SP90)之间的关系,进而抑制A ng 诱导的内皮细胞凋亡[5～7]。

本实验用培养的HUV EC s,观察前荷叶碱对A ng 诱导内皮细胞凋亡的影响,及其是否通过增加NO的生成而起作用。

结果发现,A ng 可明显降低ECV304细胞活性,显著诱导内皮细胞发生凋亡,这与L in等[5]的研究相似。

同时还发现A ng 降低tNO S的活性,同时减少HUV EC s分泌NO,但与空白对照组相比差异无显著性,这与D esideri 等[8]研究发现A ng 可激活内皮细胞NAD PH氧化酶,促使RO S产生,从而削弱NO S的活力,减少NO的分泌及生物利用度的结果相似。

而前荷叶碱能显著增强tNO S的活性,而对i N O S的活性无明显影响,从而增加HUV EC s分泌NO;同时前荷叶碱能部分拮抗A ng 诱导内皮细胞凋亡,上述两种作用在前荷叶碱浓度为1Λm o l L时最强。

说明低浓度前荷叶碱通过增强tNO S的活性尤其是eNO S 活性来增加HUV EC s分泌NO,抑制A ng 刺激RO S的产生,从而减少A ng 诱导HUV EC s凋亡,发挥其保护内皮细胞的功能。

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甘草黄酮对辣椒素诱导豚鼠咳嗽反射的抑制作用
朱一亮,谢强敏Ξ,陈季强,张水娟
(浙江大学医学院国家食品药品监督管理局呼吸药物实验室,浙江杭州　310031)
摘　要:目的　观察甘草黄酮的镇咳作用及机制。

方法　用辣椒素气雾吸入诱导豚鼠咳嗽反射,M edL ab生物信号采集处理系统记录咳嗽次数。

结果　甘草黄酮30、100和300m g kg ig给药剂量依赖地抑制辣椒素诱导的豚鼠咳嗽反射,与模型组比较咳嗽次数分别减少3217%、4913%和5916%(P<0101、01001);甘草黄酮100m g kg ig给
Ξ收稿日期:2005211222
基金项目:浙江省科技厅重点攻关项目(2006C23009)
作者简介:朱一亮(1979—),男,浙江省桐乡市人,浙江大学医学院硕士,研究方向为抗哮喘药物和镇咳药物的研发与理论研究。

T el:(0571)87230584　E2m ail:i onej ob@
3通讯作者　谢强敏　E2m ail:xieqm@
药1、4、6h可显著抑制辣椒素诱导的豚鼠咳嗽反射次数(P<0101、0105),作用8和12h对咳嗽反射无显著影响(P>0105)。

纳洛酮013m g kg(i p)可部分阻断甘草黄酮的作用,马来酸麦角新碱3m g kg(i p)或格列本脲20 m g kg(i p)不能阻断甘草黄酮的作用。

结论　甘草黄酮呈剂量依赖方式抑制辣椒素引起的豚鼠咳嗽反射,甘草黄酮(100m g kg,ig)作用持续时间为6h以上。

纳洛酮部分阻断甘草黄酮的作用,表明甘草黄酮可能间接影响内源性的阿片系统。

关键词:甘草黄酮;镇咳;辣椒素;豚鼠
中图分类号:R286142 文献标识码:A 文章编号:02532670(2006)07104804
I nh ib ition of f lavone from G lycy r rh iza u ra lens is on capsa ic i n-i nduced
cough ref lex i n gu i nea p ig
ZHU Y i2liang,X IE Q iang2m in,CH EN J i2qiang,ZHAN G Shu i2juan
(Zhejiang R esp irato ry D rugs R esearch L abo rato ry of State Food and D rug A dm inistrati on of Ch ina,
Co llege of M edicine,Zhejiang U niversity,H angzhou310031,Ch ina)
Abstract:Objective　To investigate the an titu ssive activity and acti on sites of flavone from G ly2 cy rrh iz a u ra lensis(FGU)in gu inea p ig.M ethods　Cough reflex w as induced by cap saicin aero so l in gu inea p igs.T he cough num ber of ti m es w as reco rded by M edL ab data adop ti on system.Results　FGU30,100, and300m g kg(ig)inh ib ited cap saicin2induced cough reflex in a do se2dep enden t m anner.Inh ib ito ry rates of cough reflex w ere32.7%,49.3%,and59.6%,respectively.T here w as a sign ifican tly differen t com2 p arison w ith tho se of m odel group(P<0101,0.001,respectively).FGU100m g kg m arkedly decreased cough reflex num ber of ti m es induced by cap saicin at1,4,and6h after ig adm in istrati on(P<0101, 0105),bu t had no effect at8and12h(P>0105).P retreatm en t w ith N aloxone(0.3m g kg,i p)partly b locked the effects of FGU,bu t neither m ethysergide(3m g kg,i p)no r glibenclam ide(20m g kg,i p) w o rked.Conclusion　FGU inh ib its cap saicin2induced cough reflex in gu inea p ig in a do se2dep enden t m an2 ner.FGU(100m g kg,ig)had a con tinuou s an titu ssive effect m o re than6h.Partly b lock effect of N alo2 xone on FGU suggests that FGU m igh t indirectly influence endogenou s op ium system.
Key words:flavone from G ly cy rrh iz a u ra lensis F isch.(FGU);an titu ssive;cap saicin;gu inea p ig
甘草系豆科多年生草本植物。

甘草的镇咳作用被世人延用千年,至今仍为呼吸系统疾病常用药,但多以复方配伍使用,单独使用甘草或甘草黄酮的镇咳药理研究报道很少。

A nderson等[1]报道甘草酸及其衍生物具有镇咳活性。

俞腾飞等[2]报道甘草黄酮、甘草浸膏及甘草次酸对氨水和二氧化硫诱导的小鼠咳嗽有抑制作用。

吴勇杰[3]报道甘草次酸钠抑制氨水诱导的小鼠咳嗽反应。

咳停片是一个含有甘草流浸膏和甘草浸膏的多成分复方制剂,被证明其对枸橼酸雾化吸入或电刺激喉上神经引起的豚鼠咳嗽反射具有明显抑制作用[4]。

痰咳宁也是一个含有甘草成分的复方制剂,它对枸橼酸雾化吸入引起的豚鼠咳嗽反射以及辣椒素雾化吸入引起的小鼠咳嗽反射同样具有很强的抑制作用[5]。

本实验研究甘草黄酮(以甘草苷和甘草苷芹糖为主要成分)对辣椒素雾化吸入引起的豚鼠咳嗽反射的影响,并探讨其作用机制。

1　材料
111　药品与试剂:辣椒素,批号123H78341;盐酸纳洛酮,批号446754 1;马来酸麦角新碱,批号073k1279;格列本脲,批号123k1062;以上试剂均购于Sigm a公司。

可待因,批号220103,青海制药厂。

甘草药材购于杭州中药材公司,经本校药学院生药教研室鉴定为甘草G ly cy rrh iz a U ra len isi F ishc.。

112　甘草黄酮的制备:甘草(乌拉尔甘草),新疆产,2年以上生长期。

取10kg甘草,粉碎,水提两次,定容为60L,经D iai on H P20柱,然后用40L 水提,再用50%甲醇40L提取,干燥后得250g提取物,经H PL C测定主要成分为甘草黄酮,含总黄酮50%以上,不含甘草酸。

113　辣椒素溶液的配置:称取辣椒素715m g,放入10%乙醇(1mL)和10%聚山梨酯80(1mL)的混合液中,然后在研钵内研磨至完全溶解,再用生理盐水稀释至50mL备用。

114　动物:豚鼠,300～400g,雌雄不拘,购于浙江大学医学院实验动物中心,合格证号220010014。

115　仪器:体积描记盒、差压换能器(M o to ro la)、计算机(Pen tium ,128M 30G)、M edL ab生物信号采集处理系统(M edL ab V5.0.0,南京美易公司)、动物肺机械功能测定仪、Pari m aster压缩吸入
机(德国)。

2　方法
211　引咳方法:将豚鼠置于20c m×10c m×10c m 描记盒中,稳定1m in后,用压缩吸入机气雾01015%辣椒素溶液(对照组用生理盐水代替)10 m in,生物信号采集处理系统记录自气雾开始到结束的咳嗽次数。

212　实验设计
21211　量效实验:豚鼠81只,随机分6组,每组动物数见表1。

除模型组和对照组ig生理盐水1m g kg外,其余组分别ig甘草黄酮30、100和300m g kg,可待因10m g kg,给药后1h气雾辣椒素引咳。

21212　时效实验:豚鼠81只,随机分为7组,每组动物数见表2。

除模型组和对照组ig生理盐水外,各给药组ig甘草黄酮100m g kg,分别于给药后1、4、6、8和12h气雾辣椒素引咳。

21213　作用机制分析实验:豚鼠81只,随机分为9组,每组动物数见表3。

分别为对照组、模型组、甘草黄酮组、纳洛酮+甘草黄酮组、麦角新碱+甘草黄酮组、格列本脲+甘草黄酮组、可待因组、纳洛酮+可待因组和麦角新碱+可待因组。

甘草黄酮各组在ig 甘草黄酮100m g kg前30m in(格列本脲+甘草黄酮为5m in)分别i p生理盐水、纳洛酮(013m g kg)、麦角新碱(3m g kg)或格列本脲(20m g kg)。

可待因各组ig可待因10m g kg前30m in分别i p生理盐水、纳洛酮(013m g kg)或麦角新碱(3m g kg),对照组和模型组均用生理盐水代替。

ig 给药后1h气雾辣椒素引咳。

213　统计学处理:数据均以x±s表示,组间比较采用T检验或U检验。

3　结果
311　量效关系:对照组豚鼠气雾生理盐水10m in,未见豚鼠有咳嗽反射;模型组气雾辣椒素10m in,平均咳嗽次数达22次。

甘草黄酮30、100和300 m g kg呈剂量依赖方式抑制辣椒素引起的咳嗽反射,甘草黄酮300m g kg与可待因10m g kg镇咳作用相当,见表1。

312　时效关系:与模型组比较,甘草黄酮100m g kg给药后1、4和6h咳嗽次数明显减少,其中给药后1h镇咳作用最强,差异显著(P<0101),见表2。

313　受体拮抗剂对甘草黄酮和可待因抑制辣椒素诱导豚鼠咳嗽反射作用的影响:纳洛酮+甘草黄酮组与甘草黄酮组比较,抑制率降低,但无统计学差异(P>0105),提示纳洛酮可能部分阻断甘草黄酮的镇咳作用。

麦角新碱和格列本脲对甘草黄酮的抑制作用则无明显影响。

纳洛酮明显降低可待因的抑制率,且差异非常显著(P<01001),而麦角新碱则不能降低可待因的抑制率(P>0105),见表3。

表1　不同剂量甘草黄酮对辣椒素诱导豚鼠咳嗽反射的作用Table1　Effect of FGU i n differen t doses on capsa ic i n-
i nduced cough ref lex i n gui nea p ig
组　别剂量 (mg・kg-1)动物 只咳嗽反射 (次・10m in-1)抑制率 %对照-12010±010-
模型-182213±515△△△0
甘草黄酮30131419±812333217
100141113±6103334913
30012910±6123335916
可待因1012513±5123337612
与对照组比较:△△△P<01001
与模型组比较:33P<0101　333P<01001
△△△P<01001vs contro l group
33P<0101　333P<01001vs model group
表2　甘草黄酮作用不同时间对辣椒素诱导豚鼠咳嗽反射作用的影响
Table2　Ti m e-dependen t effect of FGU on capsa ic i n-
i nduced cough ref lex i n gui nea p ig
组　别作用时间 h动物 只咳嗽反射 (次・10m in-1)抑制率 %对照-12010±010-
模型-91919±518△△△0
甘草黄酮1141113±610334312
4121313±61433312
6101314±11333217
8121817±810610
12121912±414315
与对照组比较:△△△P<01001
与模型组比较:3P<0105　33P<0101
△△△P<01001vs contro l group
3P<0105　33P<0101vs model group
表3　受体拮抗剂对甘草黄酮抑制辣椒素诱导豚鼠咳嗽反射作用的影响
Table3　I nf luence of several receptor an t agon ists
FGU effect on capsa ic i n-i nduced cough
ref lex i n gui nea p ig
组　别剂量 (mg・kg-1)动物 只咳嗽反射 (次・10m in-1)抑制率 %对照-10010±010-
模型-102216±217△△△0
甘草黄酮100141113±6103335010
纳洛酮+甘草黄酮　013+100101412±4173333712
麦角新碱+甘草黄酮　3+10061017±4193335217
格列本脲+甘草黄酮　20+100101214±5173334511
可待因1010811±5153336411
纳洛酮+可待因　013+10052014±611###917
麦角新碱+可待因　3+106618±1193336919
与对照组比较:△△△P<01001;　与模型组比较:333P< 01001;　与可待因组比较:###P<01001
△△△P<01001vs contro l group;　333P<01001vs model group;　###P<01001vs codeine group
4　讨论
甘草黄酮类物质具有较强的生物活性,近年发现甘草黄酮类化合物具有抗H I V、抗肿瘤等药理作用[6]。

本实验研究的甘草黄酮提取物主要成分是黄酮(含总黄酮50%以上),并且已经明确甘草苷和甘草苷芹糖是其中最重要的镇咳成分。

辣椒素是一种C神经纤维的兴奋剂,它与其受体类香草受体21(van illo id recep to r1,V R1)结合兴奋气道黏膜和肺组织的C纤维导致咳嗽反射,并可促使C纤维末梢释放速激肽和神经肽进入肺组织,导致气道平滑肌收缩和黏膜水肿,这一作用也可间接地导致快适应受体激活而引起咳嗽反射[7]。

本实验结果表明分离获得的甘草黄酮呈剂量依赖性抑制辣椒素诱导的豚鼠咳嗽反射,与模型组比较咳嗽次数明显减少,300m g kg甘草黄酮与10m g kg 可待因作用强度相当;甘草黄酮100m g kg一次ig 给药,作用时间可维持6h以上。

本实验还采用受体阻断法,进一步观察甘草黄酮可能的作用机制,结果发现纳洛酮013m g kg可部分阻断甘草黄酮的镇咳作用,同样剂量纳洛酮可完全阻断可待因的镇咳作用,提示甘草黄酮可能不是通过阿片受体,至少不是完全通过阿片受体起镇咳作用的,而有可能是抑制了能引起内源性阿片释放的物质,如神经肽(P 物质、神经激肽21、神经激肽22和神经激肽23等),因为内源性阿片释放和阿片受体敏感性受神经肽等递质的调节[8],并已明确神经肽21和神经肽22选择性拮抗剂可抑制辣椒素诱导的豚鼠咳嗽反射[9]。

另一种可能是甘草黄酮能直接促进内源性阿片的释放,内源性阿片的增加是否会引起成瘾性尚不清楚,但中医长期依赖应用甘草迄今尚无成瘾性的报道。

离子通道阻滞剂也是新的镇咳药物研发方向[10]。

周围镇咳药莫吉司坦(m ogu isteine)呈剂量依赖方式抑制辣椒素诱导的豚鼠咳嗽反射,这一作用可被A T P敏感的钾离子通道阻滞剂格列本脲所阻断,表明莫吉司坦可能通过钾离子通道显示其镇咳作用[11]。

本实验中格列本脲不能阻断甘草黄酮,提示甘草黄酮的镇咳作用可能不通过A T P敏感的钾离子通道。

52羟色胺(52H T)在咳嗽反射中有调节作用。

对人体,52H T缓慢静脉滴注可抑制辣椒素诱导的咳嗽反射[12],也可抑制辣椒素诱导的豚鼠咳嗽反射[13],但V an2w yk等[14]发现用52H T A1激动药丁螺环酮不能抑制辣椒素诱导正常志愿者的咳嗽反射, 52H T1受体拮抗药麦角苄酯和52H T2受体拮抗药p iso tifen对辣椒素诱导正常志愿者的咳嗽反射也无任何影响。

本实验结果显示麦角新碱(52H T受体拮抗药)对甘草黄酮和可待因抑制辣椒素诱导的豚鼠咳嗽反射无明显阻断作用,至少表明甘草黄酮的镇咳作用也不是通过52H T受体调节,尽管52H T受体在咳嗽反射中有调节作用尚有争议。

综上结果表明甘草黄酮能很强地抑制辣椒素诱导的豚鼠咳嗽反射,作用时间可持续6h以上。

推测其作用机制可能是通过直接阻断V R1受体或间接影响内源性阿片释放,但其具体作用机制仍有待研究。

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