下调hENT1可抑制胰腺癌细胞株SW1990对gemcitabine的跨膜转运

下调hENT1可抑制胰腺癌细胞株SW1990对
gemcitabine的跨膜转运1
张红刚1，徐建敏1，费晓庆2，鞠煌先2，刘胜利1
1东南大学医学院附属中大医院，南京（210009）
2南京大学化学化工学院，南京（210009）
E-mail：lsl88408@
摘要：目的: 明确下调hENT1后对胰腺癌细胞株SW1990跨膜转运gemcitabine的影响。

方法将能特异性下调hENT1的pSilence-hENT1 4.1-CMV neo的重组质粒以及对照质粒转染到胰腺癌SW1990细胞内。

采用G418筛选阳性克隆细胞，RT-PCR 检测hENT1 mRNA表达情况。

培养SW1990细胞、pSilence-hENT1Si-SW1990、pSilence-Control-SW1990细胞，三组细胞培养基中均含gemcitabine 100 µg/ml，温育0，15，30 min，1，2，4 h 后收集细胞。

取等量细胞悬液2份各100 µl，一份作为检测样本用毛细管区带电泳测定gemcitabine总量，另一份用作平行样本测定总蛋白含量。

根据蛋白——细胞数量标准曲线来确定平行样本中细胞数，再用血细胞分析仪确定细胞体积，最后，计算单细胞内药物总量及浓度。

结果pSilence-hENT1Si-SW1990细胞的hENT1 mRNA表达水平下调50%。

SW1990组用含gemcitabine (100 µg/ml)的DMEM培养基温育后，细胞内药物浓度在30 min达55.1 µg/ml±10.4 µg/ml，60 min达70.2 µg/ml±7.8 µg/ml，120 min后处于平台期(90.1 µg/ml±6.0 µg/ml)。

相比之下，pSilence-hENT1Si-SW1990组细胞内药物浓度30 min达41.3 µg/ml±4.9 µg/ml，60 min达平台期 (51.3 µg/ml±11.8 µg/ml)，与对照组相比，细胞内浓度处于较低水平(p <0.05)。

pSilence-hENT1control-SW1990组与SW1990组相比差异无统计学意义(p >0.05)。

结论：下调hENT1可以抑制胰腺癌细胞株SW1990对gemcitabine的摄取，hENT1是gemcitabine跨膜转运的主要通道。

关键词：RNA干扰，核苷载体，gemcitabine，毛细管区带电泳，胰腺癌细胞株
Gemcitabine是临床上胰腺癌化疗的一线核苷类药物，具有亲水性，不易透过细胞膜，因此需要借助核苷载体 (Nucleoside Transporters, NTs)进入胰腺癌细胞 [1]。

许多学者通过对胰腺癌细胞hENT1表达水平与gemcitabine化疗效果的研究发现，平衡型核苷载体hENT1是转运gemcitabine的主要通道，胰腺癌细胞hENT1表达水平与对gemcitabine敏感度呈正相关[2-7]。

然而，目前尚缺乏更直接的证据来支撑这一结论，如gemcitabine是如何通过hENT1进行转运，干扰或敲除胰腺癌细胞hENT1后对细胞摄取gemcitabine的能力有何影响等仍需要进一步研究。

为此，本文将采用RNAi技术下调胰腺癌细胞hENT1表达，直接验证hENT1是否为gemcitabine进入细胞的主要通路。

1.材料和方法
1.1 仪器与试剂
所使用的化学试剂均为分析纯。

gemcitabine (批号061102)由豪森制药有限公司赠送，BCA 试剂盒(批号20061115)购自碧云天公司，RIPA试剂盒(批号061102)购自上海申能博彩生物科技有限公司，乙腈及二水磷酸二氢钠购自上海凌峰化学试剂公司，小牛血清(批号060611)购自杭州四季青公司，青霉素、链霉素购自山东鲁抗医药股份有限公司，HEPES购自美国Sigma公司，胰蛋白酶、DMEM、G418购自美国GIBCO公司。

HP3DCE型毛细管区带电泳仪及毛细管柱为德国Agilent公司产品，酶标仪为日本Bio-RAD公司产品 (Model 550)，血细胞分析仪为日本Sysmex公司产品(F820)。

1本课题得到东南大学913/事业基金资助项目(9290001327)的资助。

1.2 pSilence-hENT1 4.1-CMV neo重组质粒构建与扩增
用我们以前使用的方法构建重组质粒[8]。

首先根据hENT1基因序列(Pubmed, Gene Bank number: AF079117 hENT1, 498 bp)，用Ambion公司在线siRNA设计软件设计能特异性针对hENT1的可编码shRNA的DNA片段(55 bp)，该片段由上海申能博彩生物有限公司合成。

用pSilence 4.1-CMV neo质粒作载体(4944 bp)，将DNA片断与该质粒载体进行重组，得到pSilence-hENT1 4.1-CMV neo重组质粒，将重组质粒用氯化钙法转化到大肠杆菌E.coli DH5α中扩增、提取、纯化并测序验证。

用试剂盒提供的pSilence-Control质粒作对照。

1.2.1 质粒转染与细胞筛选
SW1990细胞由东南大学医学院病理实验室提供，细胞用高糖DMEM培养液培养(含10%小牛血清、100 IU/ml链霉素、100 IU/ml青霉素，37℃5% CO2 )。

将SW1990细胞接种于六孔板(每孔2×105个)，分为pSilence-hENT1Si组、pSilence-Control质粒对照组和空白对照组。

待细胞密度达到70%进行细胞转染。

先制备质粒-脂质体混合液，即将重组质粒或对照质粒2 µg、脂质体Lipofectamine 2000 4 µl、opti-mem 200 µl混匀，室温孵育15 min。

细胞用无血清DMEM液洗涤三次后，加入质粒-脂质体混合液，再加无血清、无抗生素的DMEM 高糖培养液1.5 ml孵育5 h (37℃，5% CO2 )，然后用原普通培养液继续培养，48 h后培养液更换为含400 µg/ml G418的DMEM培养液。

经转染的细胞培养约10天后，若仍成活并形成细胞克隆，这些细胞克隆被视为阳性转染细胞，即为pSilence-hENT1Si SW1990 细胞或pSilence-Control SW1990细胞。

此后，阳性转染细胞用含维持浓度G418 (200 µg/ml)的DMEM液继续培养并扩增。

1.2.2 检测各组细胞hENT1表达
用RT－PCR检测各组hENT1的表达。

分别收集(细胞数>1×107个)。

按Trizol试剂盒说明提取RNA。

所提取的RNA用紫外分光光度计进行定量，用琼脂糖电泳 (0.01琼脂糖凝胶，电压80 V，时间30 min)检测完整性。

将RNA浓度调整至1 µg/µl备用。

hENT1探针根据基因库编码(Gene Bank number: AF079117 hENT1，1498 bp)设计，其引物序列为：上游：5’-AGC AGG CAA AGA GGA ATC TGG AGT-3’，下游:5’-GAA GGC AAA GGC AGC CATGAA GAA-3’ ，扩增片断为436 bp。

用β-actin作内参，其引物序列为：上游: 5’-CGT CTG GAC CTG GCT GGC CGGGAC C-3’, 下游: 5’-CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT G-3’，扩增片断为600 bp。

以各组RNA为模板 (1 µg)，按TaKaRa 公司试剂盒提供的方法进行RT-PCR，反应条件为94℃预变性3 min、94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸7 min。

RT－PCR终产物用0.01琼脂糖凝胶电泳分离(电压80 V，时间30 min)，电泳条带用Smartview 2001图像分析处理系统测定。

计算hENT1与内参条带光密度比值。

上述各实验重复3次。

1.3 测定gemcitabine含量
用毛细管区带电泳法方测定检测样本中gemcitabine含量[9]，采用BCA法测定平行样本中总蛋白量，再根据平行样本中总蛋白含量来确定检测样本中的细胞数量，继而计算出单细胞中gemcitabine含量，最终根据单细胞体积计算出单细胞内gemcitabine浓度。

1.3.1 gemcitabine检测条件
毛细管柱内硅胶填充(毛细管总长50 cm，有效长42.5 cm，内径50 µm)，检测前毛细管
柱依次用1 M NaOH灌洗1 min、0.1 M NaOH 1.3 min、双蒸水1.0 min、运行缓冲液1.0 min。

运行缓冲液：50 mM磷酸二氢钠，PH 3.4(取二水磷酸二氢钠1.56g加二次水至200 ml，用磷酸调节PH值至3.4)。

每次进样前再用运行缓冲冲洗5 min。

检测温度25℃，电压21 KV，检测波长200 nm，真空进样6 s，记录出峰时间及峰高。

配制gemcitabine浓度为20 µg/ml的溶液，用毛细管区带电泳 (CEZ)检测，连续进样6次，检验准确度与精密度。

取gemcitabine浓度梯度为25 µg/ml、20 µg/ml、15 µg/ml、10 µg/ml、5 µg/ml、0 µg/ml，根据峰高与浓度的关系建立标准曲线。

1.3.2 细胞准备与样品处理
将SW1990细胞，pSilence-Control-SW1990细胞和pSilence- hENT1Si- SW1990细胞分别在直径15 cm培养皿中培养至细胞数大于2×107个后，替换用含gemcitabine (100 µg/ml)的DMEM 培养液在37℃细胞培养箱温浴。

温育时间序列为0 min、15 min、30 min、60 min、120 min、240 min。

细胞温浴后即用PBS (4℃，pH 7.2)冲洗三遍，再用橡皮擦将刮下，收集细胞混悬液。

取细胞混悬液100 µl样本各两份，一份为检测样本用于测定gemcitabine的含量、另一份作为平行样本用于测定蛋白质含量。

药物空白细胞作为检测时消除背景用。

检测样本用乙腈裂解细胞并除去蛋白。

乙腈与细胞悬液按1 : 2的比例混合，震动、离心(9000 g，3 min)，取上清液进样检测，根据标准曲线计算检测样本gemcitabine浓度与含量。

实验重复3次。

1.4 细胞数量和细胞体积测定
本研究假定检测样本与平行样本细胞数一致。

根据平行样本蛋白含量来确定样本中细胞数，计算单细胞gemcitabine含量，再依细胞体积计算出细胞内药物浓度。

为确定平行样本细胞数量，先建立蛋白——吸光度标准曲线，再建立蛋白——细胞数量标准曲线，即可通过测定平行样本蛋白含量计算出检测样本中细胞数量。

根据BCA试剂盒说明，取蛋白标准品浓度序列为0 µg/ml、5 µg/ml、10 µg/ml、20 µg/ml、
℃，40 µg/ml、80 µg/ml，用BCA法测定吸光度(日本Bio-RAD550型，波长540 nm，检测温度20)制定蛋白——吸光度标准曲线。

相应数量细胞用0. 25%胰蛋白酶消化后收集，PBS定容至10 ml。

细胞悬液用血细胞计数器(Leitz Wetzlar，德国)计数得单位体积细胞数量。

取细胞悬液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml，按RIPA试剂盒说明书裂解细胞。

上清液进行蛋白吸光度测定，制定蛋白——细胞数量标准曲线。

测定平行样本蛋白含量，计算细胞数量。

计算检测样本单细胞gemcitabine含量。

细胞用0. 25%的胰蛋白酶消化后收集细胞悬液，用血细胞分析仪 (SysmexF820，日本)测定细胞平均体积。

计算检测样本细胞内gemcitabine浓度。

1.5 统计学方法
实验数据用Excel(Version 2003)和SPSS(Version 10.0)处理，数据用Mean±SD表示。

各结果组间差异采用单因素方差分析。

2.结果
2.1 hENT1 mRNA表达
RT-PCR结果显示，与SW1990细胞和pSilence-Control-SW1990细胞相比，pSilence-hENT1Si-SW1990细胞hENT1 mRNA表达下调50% (Fig 1)。

而
pSilence-Control-SW1990 细胞与SW1990 细胞相比，hENT1 mRNA表达无明显变化。

这一
结果说明本研究所采用的RNAi技术能部分下调SW1990细胞hENT1 mRNA表达，但下调作用
不完全。

为验证pSilence-hENT1Si-SW1990细胞hENT1 mRNA表达下调的稳定性，在转染细胞阳
性克隆形成后第30、60、90天分别检测了该组细胞hENT1 mRNA表达情况，结果显示下调hENT1 mRNA表达稳定性较好 (Tab 1)。

Fig 1：Expression of hENT1 mRNA in cells with RT-PCR
Tab 1: hENT1/β-actin ratio of optical density in cells
Cells d 30 d 60 d 90
SW1990 1.142
0.830
0.882
pSilence-Control-sw1990 1.125 0.846 0.835
pSilence-hENT1Si-sw1990 0.585 0.420 0.429
2.2计算单细胞内gemcitabine浓度
2.2.1毛细管区带电泳 (CEZ)方法检测gemcitabine含量
CEZ检测gemcitabine出峰时间在10 min左右，峰宽较窄，出峰处无明显杂峰(Fig 2)。

gemcitabine浓度与峰高标准曲线为y = 0.3046x -0.0905 ( r2 = 0.9989, P < 0.01)，显示gemcitabine浓度在5 µg/ml~ 25 µg/ml之间有良好线性关系 (Fig 3)。

gemcitabine最低检出浓度
约为1.0 µg/ml。

变异系数CV＜1% (n=6)。

Fig 2: Gemcitabine peak was detected by capillary zone electrophoresis. (voltage 21 kV, current 48.7 µA, sample
℃
injection 6 s, temperature 30)
2.2.2 测定细胞数量及单细胞内gemcitabine含量
用BCA法制定蛋白——吸光度标准曲线为y =14.877x+0.0272 (r2 = 0.9982, P < 0.01) (Fig 4)。

根据细胞数量和蛋白量的关系，制定蛋白——细胞数量标准曲线y = 0.9246x + 0.1229 (r 2 = 0.9939, P < 0.01) (Fig 5)。

根据gemcitabine细胞检测的平行样本中蛋白质含量与细胞数量的关系，计算出细胞平行样本中细胞数量，此细胞数量即被视为gemcitabine细胞检测样本的细胞数量。

细胞检测样本中gemcitabine含量除以检测样本的细胞数量即得单细胞内药物含量 (Tab 2)。

Fig 4: The standard curve of protein optical density vs concentration
Fig 5: The standard curve of protein content vs cell number
Tab 2：The content of gemcitabine in a single cell (pg/cell)
Time/min 15
30
60
120 240
SW1990
pSilence-Control-SW1990 pSilence-hENT1Si-SW1990120.3±11.6
124.9±16.8
80.8±11.1
145.9±27.6
146.0±18.5
109.4±13.0
185.8±20.6
211.7±16.5
135.8±31.1
238.5±15.9
241.1±13.8
149.8±8.7
239.2±11.2
249.7±6.1
136.1±18.8
2.2.3 计算单细胞内gemcitabine的浓度
根据上述单细胞内gemcitabine含量，计算单细胞内gemcitabine的浓度。

SW1990组用含gemcitabine (100 µg/ml)的DMEM培养基温育后，细胞内药物浓度在30 min达55.1 µg/ml±10.4 µg/ml，60 min达70.2 µg/ml±7.8 µg/ml，120 min后处于平台期 (90.1 µg/ml±6.0 µg/ml)。

相比之下，pSilence-hENT1Si-SW1990组细胞内药物浓度30 min达41.3 µg/ml±4.9 µg/ml，60 min达平台期(51.3 µg/ml±11.8 µg/ml)，与对照组相比，细胞内浓度处于较低水平(p <0.05)。

pSilence-hENT1control-SW1990组与SW1990组相比差异无统计学意义(p >0.05) (Fig 6)。

Fig 6：Intracellular concentration curves of gemcitabine. Each data presents the mean±SD(n = 3).Curves were
designed using non-linear regression.
3.讨论
胰腺癌预后差，五年生存率不到5％。

化疗仍然是胰腺癌治疗最主要的辅助方法。

对胰腺癌的化疗效果亦受诸多因素影响，如化疗药物透过癌细胞膜的能力、药物在癌细胞内的浓聚、药代动力学特点等。

核苷类化疗药物是胰腺癌化疗最常用的药物。

然而，核苷类化疗药物多具有亲水性，需
借助细胞膜上NTs进入细胞[1]。

肿瘤细胞膜上NTs的分布、类型、转运机制、相互作用等因素，也决定着核苷类化疗药物在癌细胞内的集聚过程和化疗效果。

根据对Na+ 依赖与否，人类NTs分为两大类，即平衡型核苷载体(human equilibrative nucleoside transporter, hENTs)和浓度依赖型核苷载体(human concentrative nucleoside transporter, hCNTs)两大类[1]。

hENTs转运核苷及核苷类药物系易化扩散，原动力来自于细胞两侧的药物浓度差，可向细胞内外双向转运，转运速度较快，其中hENT1被认为是转运核苷类化疗药物的主要通道[2]。

前人的研究显示，hENT1 表达水平与胰腺癌细胞对gemcitabine敏感度有关。

Rauchwerger DR报道hENT1高表达的胰腺癌细胞对gemcitabine敏感[3]；Spratlin J研究发现胰腺癌细胞表达hENT1的患者用gemcitabine化疗可延长生存期[4]；Mory R亦发现胰腺癌及胆管细胞癌的hENT1表达水平与对gemcitabine的敏感度密切相关[5]；Mackey JR先是报道胰腺癌细胞中ENT1缺乏者对gemcitabine阻抗增加1800倍[6]；后来Mackey JR在对乳癌患者的研究中又发现， hENT1低表达者对gemcitabine和capecitabine均不敏感[7]；这些结果都提示hENT1可能是gemcitabine进入癌细胞的最主要通路，但仍需要更有力的证据来进一步证实。

本研究先采用RNAi技术[10]来干扰胰腺癌细胞hENT1表达，然后用毛细管电泳法测定细胞内gemcitabine浓度，直接验证胰腺癌细胞膜上hENT1是否为gemcitabine进入细胞的主要通路。

本研究中，先构建pSilence-hENT1 4.1-CMV neo重组质粒，质粒中含有能特异性针对hENT1的可编码shRNA的DNA片段，shRNA在细胞内被切割为siRNA，siRNA结合并降解hENT1 mRNA，从而降低胰腺癌细胞膜hENT1数量。

RT-PCR结果显示，与SW1990细胞和pSilence-Control-SW1990细胞相比，pSilence-hENT1Si-SW1990细胞hENT1 mRNA表达下调50% (Fig 1)。

而pSilence-Control-SW1990细胞与SW1990细胞相比，hENT1 mRNA表达无明显变化。

这一结果说明本研究所采用的质粒介导的RNAi技术能部分下调SW1990细胞hENT1 mRNA表达，使hENT1表达数量减少，但下调作用不完全。

为验证pSilence-hENT1Si-SW1990细胞hENT1 mRNA表达下调的稳定性，在转染细胞阳性克隆形成后第30、60、90天分别检测了hENT1 mRNA表达情况，结果显示hENT1 mRNA表达下调的稳定性较好 (Tab 1)，这也提示在较长时间内pSilence-hENT1Si-SW1990细胞膜上的hENT1蛋白表达量是稳定的，能满足本实验的要求。

本研究参照Procházková测定单细胞内5-FU浓度的方法[9]。

用多种缓冲液以及多个检测波长摸索检测条件，当使用50 mM磷酸二氢钠 (PH 3.4)作为缓冲液时，在200 nm波长下，gemcitabine出峰时间在10 min左右，峰宽较窄，出峰处无明显干扰，gemcitabine浓度与峰高在5 µg/ml ~ 25 µg/ml范围内线性相关性好 (r2 = 0.9989, P < 0.01)，最低检出浓度为1.0 µg/ml。

未经RNAi干扰的胰腺癌细胞(SW1990)在含gemcitabine (100 µg/ml)的DMEM培养基温育后，细胞内药物浓度在30 min达55.1 µg/ml±10.4 µg/ml，60 min达70.2 µg/ml±7.8 µg/ml，120 min后处于平台期(90.1 µg/ml±6.0 µg/ml)。

与SW1990组相同，转染空白对照质粒的胰腺癌细胞 (pSilence-hENT1control-SW1990)经含gemcitabine的DMEM培养基温浴后，各时间点细胞内gemcitabine浓度与未干扰组差别无统计学意义(p> 0.05)。

相比之下，pSilence-hENT1Si-SW1990组细胞内药物浓度30 min达41.3 µg/ml±4.9 µg/ml，60 min达平台期(51.3 µg/ml±11.8 µg/ml)，与对照组相比，细胞内浓度处于较低水平(p <0.05)。

此提示胰腺癌细胞膜上hENT1是转运gemcitabine的主要通道，其表达量下调会抑制gemcitabine向胰腺癌细胞内的转运。

Marcé S在研究淋巴瘤细胞株对gemcitabine摄取能力时亦得出类似结果，即hENT1高表达者摄取能力高于低表达者[11]。

需要提及的是，虽然多数观点认同hENT1的高表达可以增加肿瘤细胞对gemcitabine的敏
感性，但在对gemcitabine的另一种类似物5-FU的研究中却得出相反的结论，认为hENT1是5-FU的主要返流通道，hENT1的高表达会影响5-FU在细胞内的浓聚，阻断hENT1可提高5-FU 在细胞内的浓度。

如Boyer CR报道用潘生丁或其衍生物阻断hENT1后，可以明显提高5-FU 的抗癌效果 [12]；我们以前的研究结果亦证实阻断hENT1可以明显提高胰腺癌癌细胞内5-FU 的浓度[13]；Tsujie M的研究则表明，当阻断hENT1后，胰腺癌细胞株PSN1摄取gemcitabine 的能力被显著抑制，而对5-FU的敏感性却大大增强[14]。

上述矛盾结果可能与二者分子结构或分子量的差异有关，如5-FU中仅含一个嘧啶环结构，gemcitabine分子结构中除了一个嘧啶环外尚有另一个环状取代基，5-FU分子量为130.08，gemcitabine分子量为299.70。

5-FU结构简单，分子量较小，可能更容易自由通过NTs通道，而双向通道hENT1对5-FU的返流可能就显得突出。

而gemcitabine结构相对复杂、分子量较大，可能局限了胰腺癌细胞的其他NTs通道的对gemcitabine转运，这将有待于今后进一步的研究证实。

4. 结论
下调hENT1可以抑制胰腺癌细胞株SW1990对gemcitabine的摄取，hENT1是gemcitabine 跨膜转运的主要通道。

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Down-regulating hENT1 inhibits gemcitabine transportation in pancreatic cancer cell line sw1990
Zhang Honggang1, Xu Jianmin1, Fei Xiaoqing2, Ju HuangXian2, Liu Shengli1
1Department of General Surgery, Affiliated Zhong-Da Hospital of Southeast University, Nanjing,
China (210009)
2Department of Analytical Chemistry，Chemistry and Chemical Engineering School，Nanjing
University，Nanjing, China (210018)
Abstract
Objective: To investigate the effect of hENT1 down-regulation on gemcitabine transportation in pancreatic cancer cell line (sw1990). Methods: pSilence-hENT1 4.1-CMV neo plasmid down-regulating hENT1 specifically and its control plasmid were separately transfected into SW1990 cells. Then the transfected cells were cloned with G418, and their hENT1 mRNA expressions were checked by RT-PCR. Cells were harvested after 15, 30 min, 1, 2, and 4 h incubation with medium containing gemcitabine (100 µg/ml). Then, two 100 µl cell suspensions in each cells were spliced, one for gemcitabine detection and another for protein quantitation. Gemcitabine contents in cells were detected by means of capillary zone electrophoresis. The cell number in 100 µl cell suspensions was defined with standard curve of protein content vs. cell number. Average cell volume was defined with hematology analyzer. The gemcitabine content and concentration in a single cell were finally counted. Results: The hENT1 mRNA expression in pSilence-hENT1Si-SW1990 cells were down-regulated to 50% compared with controls. After gemcitabine incubation (100 µg/ml), the concentration of gemcitabine in sw1990 cells was 55.1 µg/ml±10.4 µg/ml at 30 min,70.2 µg/ml±7.8 µg/ml at 60 min and 90.1 µg/ml±6.0 µg/ml at 120 min. After that, a concentration plateau was achieved. In pSilence-hENT1Si-SW1990 cells, however, the concentration of gemcitabine was 41.3 µg/ml±4.9 µg/ml at 30 min, and 51.3 µg/ml±11.8 µg/ml at 60 min, much lower than that in sw1990 cells (p <0.05). After that a platform was achieved. No difference of concentration curves was found between sw1990 cells and pSilence-hENT1control-SW1990 (p >0.05). Conclusion: hENT1 down-regulating decrease gemcitabine up-taking in pancreatic cancer cell line (sw1990). It is implicated that the hENT1 on membrane might be the key channel for gemcitabine transportation.
Keywords: RNAi, Nucleoside transporter, Gemcitabine, Capillary zone electrophoresis, Pancreatic cancer cell line。