实验三_鱼类原代细胞的制备与培养(组织块法)

实验三鱼类原代细胞的制备与培养（组织块法）
姓名：程辉辉学号：2014308110001
【实验目的】
掌握贴壁细胞原代培养的方法；熟悉贴壁细胞原代培养流程
【实验原理】
细胞培养可分为原代培养和传代培养两种。

原代培养是直接从生物体获取和切割成微小的组织块，然后贴附于培养瓶底部，并有培养液供给营养，在合适的温度中孵育，让其慢慢地长出细胞来，以获得大量均一的细胞，为以后传代培养创造条件。

【器材、材料与试剂】
（一）仪器
生化培养箱，倒置显微镜，超净台，加液枪。

（二）材料
培养瓶，平皿，5m L移液管，15ml、50ml离心管，纱布块，穿刺针，废液缸，手术剪镊，无菌解剖刀，75%酒精，50ml小烧杯，试验幼鱼。

酒精棉球，酒精灯，橡皮头，软管，记号笔。

（三）试剂
AIM：90 mL培养液+ 5 mL GPS（10×）+5 mL两性霉素B（250μg/mL）+1 mL硫酸庆大霉素（50 mg/mL）混合，4℃保存；
原代培养液：80 mL培养液+2 mL GPS (10×)+20 mL FBS+ 表皮生长因子EGF（2μg/mL）+ 成纤维生长因子FGF（25 ng/mL）混合，4℃保存；
传代培养液：90 mL培养液+1 mL GPS (10×)+10 mL FBS混合，4℃保存
【实验步骤】
工作前打开紫外灯，消毒30分钟；入无菌室之前用肥皂洗手（或带手套），用75%的酒精擦拭消毒双手；超净台面应整洁，用75% 酒精喷洒，纱布擦净；所有试剂瓶等培养用具需用酒精擦拭后放入超净台。

将灭菌的手术器械（解剖刀2把，镊子一把，眼科镊一把，眼科剪一把）插入盛有75%酒精的玻璃小烧杯中浸泡和备用。

以下操作均在超净台里。

首先用5ml 移液管吸AIM（消毒培养液）到无菌平皿中。

1. 杀幼鱼与消毒体表：将小幼鱼置于75%酒精中，浸泡30秒。

2. 取鳔：继续用消毒纱布托住鱼体，用手术剪取鳔，并置于盛有AIM培养基的培养皿（1）内浸泡消毒，写上组织编号。

3. 用纱布擦去手术器械上的残余组织，将手术器械轻轻插在盛有酒精的小烧杯中涮洗浸泡。

然后用浸泡在酒精杯里的眼用剪打开腹腔，拨去腹膜，换用新的镊子取出肝脏，并置于盛有AIM的培养皿（2）内浸泡消毒，另写组织编号。

注意，取不同的解剖层次和不同的组织时，其消毒器械应擦洗，以防组织细胞交叉污染致互相残杀。

4. 组织块在AIM 液里浸泡2小时（吃饭时间最适），中间每半小时换一次AIM培养基。

5. 换液的方法：倒去旧液，用移液管取新液（AIM）加入，涮洗AIM中的组织块，如此反复2次。

6. 用酒精杯里的眼用弯头镊，将组织块移入无菌皿（3）（4）内，用手术刀切除和刮去多余的坏组织（也可以移到平皿的盖子里刮组织，节省平皿），坏组织如脂肪和坏死组织，血液、
筋膜等，将筋膜等坏组织捻到原平皿(1)、(2)中(弃去)，再用新移液管吸AIM清洗平皿（3）（4）（或平皿盖子）内的组织1-2次。

7. 用手术刀将组织块切成约1mm2的小块
8. 用新移液管吸AIM少量，将组织碎块浸润。

9. 打开培养瓶盖（盖子斜置于酒精灯旁的架子上，不应扣放台面，以防污染）。

用新移液管吸取湿润的微小组织块（约20-30个），接种于25 cm2培养瓶底部，加盖后，将瓶子平铺，让里面的组织均匀分布在瓶底壁。

10. 用移液管将底部的组织涂抹均匀，烧瓶口和加盖后拧紧盖。

11. 轻轻将培养瓶拿到培养箱内平放，组织干贴2小时，然后将培养瓶侧放半小时，让液体浸出，再在超净台用移液管将残余液体吸出。

12. 用新移液管从边角缓慢加入4-5 mL培养基，使细胞慢慢接触到培养基，烧口，拧紧盖，再轻轻将瓶子拿入培养箱内，轻轻翻转过来平放入培养箱内继续培养。

13. 每天观察细胞生长情况，大约2周后，细胞开始从组织块底部延伸出来。

当细胞长满时，可消化传代，原瓶可保留继续生长细胞。

如果细胞生长状态不好，堆积生长，可采取原瓶传的办法。

【结果分析】
2015.5.6鲫鱼肝脏原代培养（鳔组织原代培养结果与肝脏组织类似，但当时并未拍照）鲫鱼鳔和肝脏组织经过7天的原代培养，观察发现部分脱落的组织块悬浮于培养液中，而贴壁的组织块周围并未如预期长出新的细胞，可能是由于在静置7天的过程中，被其他人挪动过，导致其贴壁不良而未能正常生长。

【注意事项】
1．培养材料的选择，尽量选取幼小的生物体组织或者繁殖能力较强的组织，如幼鱼、胚胎、肿瘤组织等。

2. 要注意无菌操作，其要求应高于外科手术，手不能碰培养瓶口，也不能在瓶口上方操作，以免污染气体进入瓶内，
3. 应待组织块略干燥，能黏附于瓶壁时再使之与培养基接触，操作要轻，勿使组织块漂浮起来。

如果组织块没有贴壁，则细胞不易生长。

4. 移液管吸了废弃液后，应丢掉，重新换移液管，不能将吸了废弃液的吸管再伸进瓶子里去吸新液，以防组织细胞交叉污染，切记！。