实验室检测技术概要 ppt课件

病 毒
标本采集与送检
分 离
病毒的分离鉴定
和 鉴
电镜技术
定
的
血清学试验
一
般
分子生物学技术
程
序
实验室检测技术概要
常用检测方法
分离培养 血清学 中和试验 补体结合试验 血凝及血凝抑制试
验 免疫扩散试验
免疫学诊断技术 ELISA IFA 免疫组化 分子生物学检测 PCR 分子杂交技术
实验室检测技术概要
实验室常用检测 技术简要介绍
实验室检测技术概要
主要内容
➢ 概述 疾病鉴别诊断过程
临床症状和大体病变检 病料的采集及处理
➢ 病料中细菌的检测 ➢ 病料中病毒的检测
实验室检验
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一 、疾病鉴别诊断过程
临床标本的采集及处理
原则
合理的采样时机 正确的采样方法 适宜的采样部位
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一 、标本采集
尽量在病程的早期采集；标本应放置无菌容器中；标 本应做适当的标记，如动物、地点、时间、暂定的诊断等。 1 唾液在生理理盐水中常加0.5%明胶或BSA，以保护不稳定 病毒。 2 鼻、咽及肛门拭子 3 粪便标本 4 脑脊髓液、心包液、尿液等 5 尸体材料 死后应尽早获取，无菌采取，不使用防腐剂。 不同病毒所取材料不同，如NDV，取脑、气管，FMV取 肺、PRRS取肺、SFV取淋巴结等。
光定量PCR方法。实验结果：
107copies/uL 106copies/uL
105copies/ul lL
10copies/uL 阴性对照 1copy/ul
图2.5:重复性及灵敏度检测
图2.3：标准曲线
1copy
图2.4 融解曲线
1 2 4 3
引物二聚体
图2.6 特异性检测 1）牛型分枝杆菌；2）结核分枝杆菌；3）BCG；4）阴性对照
病毒分离
标本采集
杀灭杂菌
（青链霉素）
接种
三大方法
易感动物 出现病状 鸡胚 病变或死亡 细胞培养 细胞病变
鉴定病毒种型
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病毒的分离与鉴定
1．动物接种
2．鸡胚培养 3．组织培养
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病毒中和试验
本实验极为特异和敏感，是病毒学中重要的血清学实验。主要用 于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、不同病毒株的抗原关 系研究、疫苗免疫原性的评价、免疫血清质量的评价以及实验动物中 是否存在相应的抗体等。
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市场上常见的实时荧光PCR仪
罗氏Lightcycler
MJ opticon2
伯乐icycler
ABI7000
杭州博日（原大和）linegene
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病原学检测常用的实验室技术
分离培养 （“金标准”） 形态学检查 （病毒 电镜镜检） 细菌的生化试验 动物实验 免疫学诊断技术 ELISA IFA 免疫组化 分子生物学诊断技术 PCR 荧光定量PCR
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二、病料中细菌的检测方法
细菌的形态学检查 细菌的分离培养 细菌的生化试验 动物试验 血清学试验 分子生物学方法
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革兰氏染色
染色原理及过程：
革 兰
初染（结晶紫）
氏 阳
性
媒染（碘液）
脱色（ 95％酒精）
复染（复红）
革 兰
氏
阴
性
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细菌的生化试验
靛基质试验
硫化氢试验 糖发酵试验 MR试验
VP试验
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药敏试验示意图
贴上药敏纸片 2
温箱培养 3
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细菌的形态观察
光学显微镜下细菌的形态
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光镜和电镜的比较
大 肠 杆 菌
葡 萄 球 菌
光学显微镜镜检
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电镜镜检
培养结果
初次分离
纯培养
鉴别培养
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麦康凯平板
不乳糖
发酵乳糖
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EMB平板
不发酵乳糖的细菌
大肠杆菌，呈现黑色金属光泽
virus
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补体结合反应
Ag
补体
Ab
红细胞
溶血素
溶血 （-）
Ag
补体
红细胞
不溶血 （+）
Ab
溶血素
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免疫扩散
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电镜技术
鸡痘病毒（超薄切片）
狂犬病毒包涵体 （Negri body）
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ELISA分类
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PCR原理:实质就是体外基因复制技术
靶序列
Mg2+
dCTP dGTP dUTP dATP
Primer
Taq DNA聚合酶
加热变性95 °C
AmpErase
靶序列引物退火55 °C 引物延伸72 °C
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原理图示
一
二
三 完成一个循环
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30次循环后靶序列扩增的数量
1 cycle = 2 Amplicon
精确定量部分关键样品；融解曲线鉴定PCR有无杂带、引物二聚体；
染料法的缺点：无模板特异性 不能分辨主带与杂带，给出的是总信号；不能做多
重检测 每孔只能检测一个目标基因；灵敏度低适合于5000 拷贝以上的基因定量。
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举例：基于结核分枝杆菌插入序列IS1081，建立SYBR Green荧
1
2
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
20
1,048,576
30
1,073,741,824
荧光定量PCR Taqman 技术
• 特异性荧 光双标记 探针
• Taq酶 5’→3’ 外切酶活 性
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SYBR Green I染料法
与DNA结合时发光
游离时不发光
染料法的优点：成本低不需要探针；适合初步筛查先用SYBR筛查，再用TaqMan
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二 标本的保存和运送
尽量活体送检，大部分病毒不稳定，必须尽快送实 验室；如有延误，则标本必须冷藏，到实验室立即处 理和接种，延误时间短的，可置4℃；时间延误较长， 置-70℃。
如邮寄标本则需放置有干冰的保温箱内。
三 标本处理
1 体液 可以直接接种、检测 2血标本 凝固血离心后的血清即可用于检测 3各种拭子 4粪便标本 5 组织材料
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SS平板
大肠杆菌或者别的发酵 乳糖的肠杆菌
有黑色中心的是沙门氏菌。如果 没有黑色中心，就很可能是志贺 氏菌了。实验 Nhomakorabea检测技术概要
HE（苏木素伊红)琼脂平板
不发酵乳糖的某种肠
发酵乳糖的某种肠杆菌。 道菌，而且产生硫化 氢，可能是沙门氏菌
不发酵乳糖的肠道菌， 可能就是志贺氏菌。
本培养基倾注平皿待冷却后呈草绿色，质控菌株接种后。36±1℃培养 18—24h，观察结果 。大肠杆菌部分被抑制，橙黄色-橙红色。葡萄球 菌生长被抑制。
No Image
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ELISA Procedures
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分子生物学方法
PCR
(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)
荧光实时定量PCR （real time PCR） NASBA （依赖核酸序列的扩增）
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涂布细菌 1
测量抑菌圈 4
以大肠杆菌为例：
1. 剖检（采集病料） 2. 纤维素渗出物的涂片染色 3. 分离培养（普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平
板或伊红美兰琼脂平板） 4. 培养物涂片G染色 5. 生化试验 6. 动物试验 7. 血清学实验 玻板凝集鉴定血清型
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三、病料中病毒的检测
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
7 cycle = 128 Amplicon
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No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target