羊痘病毒早期蛋白的表达及蛋白间相互作用的初步研究

羊痘病毒早期蛋白的表达及蛋白间相互作用的初步研究
羊痘在世界许多国家均有发生,一旦出现疫情,往往呈现暴发性流行,对养殖业会造成极大的经济损失,影响羊副产品的进出口贸易。

近年来,国外对痘苗病毒早期蛋白的研究发现,痘苗病毒的几种早期蛋白直接或间接的影响了痘苗病毒的装配,导致病毒无法形成正常的病毒粒子,目前尚未见羊痘病毒早期蛋白对病毒复制装配影响的报道,而痘苗病毒又是痘病毒科的模式病毒。

故本研究对羊痘病毒五种蛋白(L2R、A6L、F10L、A11R、H7R)进行了表达,并通过酵母双杂交对这几个蛋白间的相互作用进行了研究。

1、提取羊痘古浪毒株全基因组,通过PCR克隆扩增L2R、A6L、F10L、A11R、H7R五个基因,并将它们分别连接到PMD19-Simple载体,转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态中,提取质粒后使用BamHI+NotI内切酶进行双酶切,然后回收酶切片段,快速连接后构建原核表达载体,测序后将获得重组载体转化入大肠杆菌Rosetta感受态中进行诱导表达,通过Western blot验证,结果表明L2R、A6L、F10L、H7R四个蛋白得到表达。

2、对L2R、A6L、F10L、H7R四个基因进行克隆,分别连接到酵母的诱饵载体pGBKT7与捕获载体pGADT7中,随后分别转化入酵母感受态Y2HGold及Y787中,诱饵载体进行自激活及毒性验证后,进行酵母mating,先将mating产物在
-Trp/-Leu二缺培养板中进行初筛,第二轮筛选在-Trp/-Leu/-X-A-Gal/Aba进行,第三轮筛选在-Trp/-Leu/-His/-Ade/-X-A-Gal四缺板中进行,第四轮筛选在
-Trp/-Leu/-His/-Ade/-X-A-Gal/Aba四缺板中进行。

结果pGBKT7-F10L有自激活,-Trp/-Leu/-His/-Ade/-X-A-Gal/Aba四缺板中仅有pGBKT7-A6L和
pGADT7-H7R杂交中有蓝色菌落。

本研究克隆了羊痘病毒五个早期蛋白基因并进行了诱导表达,随后通过酵母
双杂交研究了A6L蛋白与H7R蛋白间的相互作用。

为研究羊痘病毒装配机制、进一步为羊痘疫苗的研发奠定了基础。