关于生物防治的论文

昆虫杆状病毒的研究与应用现状
摘要：杆状病毒是节肢动物的专性病原物，多见于昆虫纲的鳞翅目昆虫。

在昆虫杆状病毒中昆虫杆状病毒表达载体系统的建立和发展，被誉为20世纪80年代真核表达研究领域的一个重大进展。

文章重点介绍了昆虫杆状病毒表达载体系统的研究和在基础研究领域，农、林业的应用现状。

关键词：昆虫杆状病毒表达载体系统，基础研究，农、林业
昆虫杆状病毒包含核型多角体病毒和颗粒体病毒两大类，是昆虫专一性病原物，对目标害虫致病性强，不产生抗药性，田间释放安全、环保。

同时由于病毒粒子被抗逆性很强的蛋白（多角体蛋白或颗粒体蛋白）所包裹，在环境中较为稳定，制成农药制剂后，货架寿命相对较长，使用方便，具有很强的商品属性。

其中，昆虫杆状病毒表达载体系统具有表达水平高、表达产物可进行翻译后加工，并可通过感染昆虫幼虫而实现大规模低成本生产基因工程产品。

早在上世纪70年代，昆虫杆状病毒就被美国食品与药品管理局和世界卫生组织推荐为安全的生物杀虫剂用于害虫的防治。

当前，环境保护和食品安全问题日益受到关注，如何解决植物保护和环境污染、农药残留之间的矛盾，是植保工作者必须面对的课题。

昆虫杆状病毒杀虫剂作为生物农药中的重要成员，应该为此做出贡献。

我国昆虫病毒杀虫剂的产业化开发已有30年的历史，有过骄人的成绩，然而同其它产业化成功的生物农药相比（如Bt、井冈霉素、阿维菌素等），无论在生产规模、质量标准、市场份额、社会影响等诸多方面，都存在巨大的差距。

一、昆虫杆状病毒的研究
昆虫杆状病毒是最大的环状单一双链DNA病毒，其基因组在90～230 kb之间，具有编码上百种蛋白质的能力。

该病毒基因组可在昆虫细胞核内进行复制和转录，其巨大的DNA复制后组装在杆状的核衣壳内。

由于昆虫杆状病毒DNA具有大量的非复制必需区，能容许基因缺失或替换，且其较大的柔软性，能容纳大片段外源DNA的插入，这为昆虫杆状病毒的重组提供了广阔发展空间。

在昆虫杆状病毒的研究中，杆状病毒表达载体系统是一个以昆虫杆状病毒为外源基因载体，以昆虫和昆虫细胞为受体的表达系统。

与细菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统相比，它具有表达水平高、表达产物可进行翻译后加工，其抗原性、免疫原性和功能等生物活性与天然蛋白相似，并可通过感染昆虫幼虫而实现大规模低成本生产基因工程产品。

因此，昆虫杆状病毒载体系统的建立和发展，被誉为20世纪80年代真核表达研究领域的一个重大进展。

1、昆虫杆状病毒表达载体系统原理
昆虫杆状病毒表达载体是一种辅助性依赖(仅有质粒载体不能表达外源基因，还需野生型杆状病毒辅助，形成整合有外源基因的重组型杆状病毒才能完成外源基因的表达)的真核DNA表达载体。

所用转录调节信号是单一或多个杆状病毒的启动子，分别有极早期、早期、晚期、极晚期等几种类型启动子，其中最常用的是极晚期启动子－多角体蛋白启动子(polyhedrin(PH)启动子)和P10。

有3种最常见的寄主细胞系用于BEVS中：Sf9，sr21，TN581—4(High-5细胞)[1]；有2种最常见的寄主昆虫用于BEVS中：家蚕和柞蚕[2]。

2 、昆虫杆状病毒表达载体系统构建方法
构建重组昆虫杆状病毒，其关键在于构建转移载体质粒。

经过10余年的努力，人们已经构建了大量用于不同目的与不同需要的转移载体质粒。

其基本要点是在基础质粒上插人多角体蛋白基因及其两端侧翼，并在多角体蛋白基因启动子
之下的编码区产生缺失，去除编码序列，然后在此缺失部位插人多接头，用于外源基因的克隆。

用此载体与亲本病毒共转染昆虫细胞，利用载体中多角体蛋白基因的两端侧翼与亲本病毒DNA之间的同源性进行重组，从而获得含外源基因的重组病毒。

从理论上讲有2种重组体形成方式，而这2种方式仅仅在于外源基因与杆状病毒基因组重组的方式不同，即在昆虫细胞胞内或在昆虫细胞胞外进行。

2．1 在昆虫细胞胞内重组
较早时是用未加修饰的野生型病毒和转移载体进行重组，后来渐渐被线性化的病毒DNA代替，这种线性病毒DNA不能在胞内复制，因此不能启动感染，除非通过同源重组被拯救为环状的复制型[3]。

当它与转移载体共转染昆虫细胞时，如果不发生同源重组就无野生型病毒背景出现，故该系统同源重组率在理论上可达100％。

近年来对经典方法进行了许多改良，如直接克隆：已有一些昆虫杆状病毒载体包含了一个不依赖于克隆技术的重组体系。

该体系避开了在大肠杆菌中克隆，加速了重组过程。

2．2 在昆虫细胞胞外重组
在昆虫细胞外将外源基因重组到病毒基因组，并且仅用重组杆状病毒DNA 转染昆虫细胞。

在昆虫细胞外重组的技术至少已有3种：(1)在大肠杆菌胞内重组；(2)在酵母菌胞内重组[4]；(3)不需要转移载体的体外重组[5]。

Perkman等创建了噬菌体P1的Cre—Lox重组系统，通过利用噬菌体P1编码Cre重组酶和它的底物LoxP获得高的重组效率，同时通过颜色选择快速、简单地进行重组体鉴定。

但该法需要用空斑法在昆虫细胞中进行重组病毒的纯化，所以操作起来相当繁琐。

如果能在大肠杆菌或酵母中扩增病毒DNA，并且让同源重组也可以在其中进行，那么重组病毒的筛选就会变得快速简便。

二、昆虫杆状病毒的应用现状
二十世纪50年代，我国科学家开始昆虫杆状病毒的基础性和应用性研究。

从六五国家科技攻关开始，设立了多个病毒杀虫剂应用的研究专题，进行了大量的科技攻关，取得了显著的成果。

有二十种左右杆状病毒杀虫剂进入田间试验或实际应用，包括：棉铃虫、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、苜蓿银纹夜蛾、春尺蠖、舞毒蛾、木毒蛾、美国白蛾、甘蓝夜蛾、茶毛虫、灰茶尺蠖、茶尺蠖、大蓑蛾、油桐尺蠖等核型多角体病毒，小菜蛾、菜青虫、黄地老虎、杨扇舟蛾、玉米螟、茶蚕等颗粒体病毒。

近年来昆虫杆状病毒表达载体系统的发展扩展了昆虫杆状病毒的用途。

在许多领域包括基础研究领域，医药、检疫领域，农、林业等有广泛的应用。

1、基础研究领域中的应用
在功能基因组学方面，利用昆虫杆状病毒表达载体系统表达量高的特性，通过简单操作，大量生产各种活性蛋白质，进而利用杆状病毒表面展示技术对相应蛋白进行表面展示，这为蛋白质的结构与功能研究，蛋白质间以及蛋白质和核酸间的相互关系研究提供了便利；对昆虫生理、生化和内分泌进行研究，首先就必须获得纯品小多肽，如神经肽以及其它多肽(它们在虫体中都是微量存在)，而用昆虫杆状病毒载体即可获得大量的具有生物活性的肽[6]。

2、农、林业的应用
在害虫综合治理中，化学农药部分地被取代是一个趋势。

对取代化学农药的杀虫剂要求更加高效、廉价、并有利于环境安全。

尽管NPV已应用于保护农作物和森林，但国际农药市场的200亿美元的杀虫剂市场中，NPV杀虫剂不过0．2％，显然不太相称。

NPV作为生物杀虫剂的突出优点是对人体安全，不杀伤天敌，不污染环境；但其过高的宿主特异性及缓慢的发病致死过程也影响了病毒杀虫剂的
商品化进程。

目前，国内外科学家正致力于研究杀虫效果提高的重组杆状病毒。

基因工程病毒杀虫剂的研制，不仅可以克服NPV的固有缺点，而且还为扩大病毒
杀虫谱提供了可能。

当前，利用杆状表达载体系统构建的重组病毒在杀虫效果上
有了很大改善，如通过同时表达2种蝎毒LqhlT2和Lqhit，使AcMNPV的杀虫时
间缩短了35％，显示了良好的应用前景[7]。

另外，采用构建重组高效表达外源毒
蛋白的F10，FA，OClZ基因的强启动子以提高野生型NPV的毒力，以及通过缺失
昆虫杆状病毒egt基因和在杆状病毒基因组中整合各种增效蛋白基因(如病毒增
效蛋白基因enhancin)以提高杀虫效果的研究也取得了相当大的进展，这为杆状
病毒的进一步推广应用奠定了坚实的基础。

昆虫杆状病毒杀虫剂是一类前景非常广阔的生物杀虫剂，从生产、市场、田
间应用等方面进行深入研究，切实解决其中的关键问题，将会把整个行业提升到
一个新的水平和高度。

从现有的技术水平和发展趋势看，杆状病毒主要以活体昆
虫增殖生产为主，属劳动密集型产业。

分析国内外农药市场对杆状病毒杀虫剂的
需求，特别在西方发达国家，将呈现迅速上升的趋势。

在昆虫杆状病毒研究和应
用技术研究方面，我国已处于世界先进行列中，加上我们具有劳动力资源的优势，因此大力发展这一产业优势凸显，必将为保护全球生态环境做出贡献。

参考文献：[1]宋德伟，马燕，冯颖，陈晓鸣，林业科学研究，2004，17（1）：116~124
[2]郑文云，马兴元，潘树德，生物技术，2001，11（2）：36~37
[3] Kitts P. A .,Possee R . D.,Gerard F . B. Virology ,1993,314(5):810
[4] Patel G . ,Nasmyth K . ,Jones N . Nucl . Acids Res . ,1992,20(1):97~104
[5]Emst W . J. , Grabherr R . M. ,Katinger H .W. Nucl . Acids Res . ,1994,22:2855~2856
[6]朱江，吴祥甫。

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[7]Inceoglu A . B . ,Kanita S . G . , Hinton A . C . , Huang Q . , S everson T . F . et al . est Manag . Sci . , 2001,57:981~987。