211091449_超声辅助提取苦丁茶多糖的工艺优化及其对黄嘌呤氧化酶抑制活性

卢忠英，张孟琴，陈祥. 超声辅助提取苦丁茶多糖的工艺优化及其对黄嘌呤氧化酶抑制活性[J]. 食品工业科技，2023，44（8）：228−235. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022070019
LU Zhongying, ZHANG Mengqin, CHEN Xiang. Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction of Ilex latifolia Thunb.Polysaccharide and Its Effect on the Inhibitory Activity of Xanthine Oxidase[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(8):228−235. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022070019
· 工艺技术 ·
超声辅助提取苦丁茶多糖的工艺优化及其
对黄嘌呤氧化酶抑制活性
卢忠英1, *
，张孟琴2，陈　祥1
（1.贵州食品工程职业学院食品工程系，贵州贵阳 551400；2.铜仁学院材料与化学工程学院，贵州铜仁 554300）
摘　要：目的：优化苦丁茶多糖的提取工艺，分析其对黄嘌呤氧化酶的抑制活性。

方法：以得率为指标，采用响应面优化超声辅助法研究料液比、超声时间、超声温度、超声功率对苦丁茶多糖的得率的影响；通过体外实验测定苦丁茶多糖对黄嘌呤氧化酶的抑制率及其动力学常数K i 。

结果：响应面试验优化条件为：料液比1:25 g/mL ，超声时间60 min ，超声温度40 ℃，超声功率260 W ，得到得率为5.85%。

苦丁茶多糖对黄嘌呤氧化酶的抑制率随物质量浓度增大而增加，IC 50为1.28 mg/mL ，其对黄嘌呤氧化酶抑制作用类型属于竞争性可逆抑制，抑制动力学常数K i 为0.62 mg/mL ，结论：苦丁茶多糖能够抑制黄嘌呤氧化酶的活性，其可作为潜在的预防高尿酸血症的食品或保健品进行深入研究，以期对苦丁茶的综合利用提供理论数据。

关键词：苦丁茶，多糖，响应面分析法，黄嘌呤氧化酶，抑制作用
本文网刊:
中图分类号：TS201.2 文献标识码： B 文章编号：1002−0306（2023）08−0228−08DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2022070019
Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction of Ilex latifolia Thunb. Polysaccharide and Its Effect on the Inhibitory Activity of
Xanthine Oxidase
LU Zhongying 1, *，ZHANG Mengqin 2，CHEN Xiang 1
（1.Department of Food Engineering, Guizhou Vocational College of Foodstuff Engineering, Guiyang 551400, China ；
2.Institute of Material and Chemical Engineering, Tongren University, Tongren 554300, China ）
Abstract ：Objective: To optimize the extraction process of Ilex latifolia Thunb. polysaccharide and analyze its inhibitory activity of xanthine oxidase. Methods: A response surface optimization ultrasound-assisted method was used to study the effects of material/liquid ratio, ultrasonic time, ultrasonic temperature and ultrasound power on the yield of Ilex latifolia Thunb. polysaccharide, and the inhibition rate of Ilex latifolia Thunb. polysaccharide on xanthine oxidase and its kinetic constant K i were determined by in vitro experiments. Results: The optimized conditions of the response surface test were:The material/liquid ratio was 1:25 g/mL, the ultrasonic time was 60 min, the ultrasonic temperature was 40 ℃, the ultrasonic power was 260 W and the yield rate was 5.85%. The inhibition rate of xanthine oxidase by Ilex latifolia Thunb.polysaccharide was concentration-dependent with an IC 50 of 1.28 mg/mL, the type of inhibition of xanthine oxidase was competitive and reversible with an inhibition kinetic constant K i of 0.62 mg/mL. Conclusion: Ilex latifolia Thunb.polysaccharide could inhibit the activity of xanthine oxidase and its could be studied as a potential food or health product for the prevention of hyperuricemia, with a view to providing theoretical data on the comprehensive utilization of Ilex latifolia Thunb..
收稿日期：2022−07−04
基金项目：贵州省科技厅项目基金（黔科合平台人才[2020]5009）；贵州省普通高等学校青年科技人才成长项目基金（黔教合KY 字[2019]176号）；铜仁
市科技平台项目基金（铜市科研（2019）94号）。

作者简介/通信作者*：卢忠英（1987−），女，硕士，副教授，研究方向：天然产物化学成分分离与应用，E-mail ：****************。

第 44 卷 第 8 期食品工业科技
Vol. 44 No. 82023 年 4 月
Science and Technology of Food Industry
Apr. 2023
Key words：Ilex latifolia Thunb. (ILT)；polysaccharose；response surface methodology (RSM)；xanthine oxidase (XOD)；inhibition
痛风（Gout）是由嘌呤代谢紊乱引起的血尿酸浓度维持持久升高状态，导致尿酸盐沉积于软组织、关节组织的代谢疾病[1]。

国家风湿病数据中心（CRDC）数据显示，目前我国高尿酸血症患者达到了1.7个亿，发病率呈年轻化现象。

研究发现高尿酸血症与心血管病呈相关性[2−4]。

黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）是在生物体内能通过氧化作用产生尿酸的一种关键酶，尿酸产生的量过多或排泄的量减少会引起高尿酸血症[5−6]。

黄嘌呤氧化酶抑制剂在临床上被作为降尿酸药品之一，如别嘌呤醇，其降尿酸功效显著，但长时间使用会对人体肝肾功能产生毒副作用[7]，而安全无毒的药食同源材料是目前开发和研究的方向[8−9]。

苦丁茶（Ilex latifolia Thunb.，ILT）属于冬青科冬青属乔木植物，作为一种茶饮品在我国海南、贵州、湖南、湖北、四川等地广泛饮用，苦丁茶具有清热解毒、解酒利尿、降脂减肥、润肠通便等作用[10−15]，苦丁茶在民间常用于治疗热病、解毒、腹痛和利尿等[16]。

苦丁茶提取物中含有约200多种化合物，如黄酮类、多糖类、生物碱，挥发油等[17]，其活性成分能有效的降低血清中的胆固醇、甘油三脂、低密度蛋白[18]。

据报道植物多糖具有抗氧化性、抗辐射、免疫等功能[19−22]，目前受到食品医药领域的广泛重视，Yoon等[23]研究叶素在体外对XOD抑制试验，结果表明其IC50值0.35±0.13~0.41±0.1 μg/mL之间均表现XOD抑制作用。

姚兰等[24]研究苦丁茶化学成分及其生物活性研究，结果显示苦丁茶活性物质能抑制XOD活性。

当前人们对苦丁茶多糖活性研究报道是具有抗氧化、抑菌、降血糖、免疫调节、肝保护等功能活性，苦丁茶多糖对XOD抑制作用尚未见报道。

目前苦丁茶多糖的提取方法常用水提醇沉法、微波法、超声波法、超临界流体萃取法等，用不同提取工艺得到苦丁茶多糖得率在0.65%~8.14%之间，存在差异可能与提取原料、方法，温度、时间多种因素有关[18]。

为实现苦丁茶多糖提取操作简单、高效、低成本、高得率的特点，本文采用超声辅助提取苦丁茶多糖，并研究苦丁茶多糖对黄嘌呤氧化酶抑制活性作用，挖掘苦丁茶多糖潜在利用价值，以期为进一步提高苦丁茶的综合开发与利用提供依据，为食品业研究提供理论参考。

1　材料与方法
1.1　材料与仪器
苦丁茶（原料）　购于铜仁一树药业连锁店，通过贵州省铜仁学院陈仕学教授鉴定为冬青科冬青属乔木植物苦丁茶叶；黄嘌呤（批号：190218）、别嘌呤醇（批号：190512）、黄嘌呤氧化酶（批号：190811）　购于上海源叶生物科技有限公司，氢氧化钠　天津市恒兴化学试剂制造有限公司；葡萄糖　HPLC≥98%，上海金穗生物科技有限公司；苯酚、30%过氧化氢、水杨酸、七水合硫酸亚铁　天津市兴复精细化工研究所；以上均为分析纯。

SG5200HP超声波清洗器　上海冠特超声仪器有限公司；Alpha-1860A紫外可见分光光度计　上海普天仪器制造有限公司；TDL-80-2C医用低速离心机　江苏省常州市康仁医疗器械有限公司。

1.2　实验方法
1.2.1 苦丁茶多糖提取工艺流程及操作要点　苦丁茶粉粹→取样→超声波辅助提取→过滤→浓缩→无水乙醇反复交替洗涤醇沉→离心→得苦丁茶多糖。

按魏晴等[25]的方法优化改进，取苦丁茶200 g 于70 ℃的烘箱中24 h烘干后粉碎过80目的筛子，将其转入1000 mL锥形瓶中，80 ℃水提2 h，浓缩至小体积后取三氯乙酸除去其中蛋白质，重复操作3次，再用无水乙醇沉淀24 h，在转速3500 r/min条件下离心5 min，无水乙醇冲洗沉淀后真空冷冻干燥，得苦丁茶多糖，用硫酸-苯酚法测得苦丁茶多糖纯度大于72%，密封待用。

1.2.2 单因素实验　设温度为40 ℃，提取时间为30 min，超声功率为260 W，考察料液比在1:20、1:25、1:30、1:35、1:40 g/mL对苦丁茶多糖的得率的影响；设料液比1:30 g/mL，超声温度40 ℃，超声功率260 W，考察超声时间在15、30、45、60、75 min 对苦丁茶多糖得率的影响；设料液比1:30 g/mL，超声时间60 min，超声功率为260 W条件下，考察在20、30、40、50、60 ℃范围内超声温度对多糖的得率的影响；设料液比1:30 g/mL，超声时间60 min，超声温度在40 ℃为条件，考察在195、260、325、390、455 W范围内超声功率对苦丁茶中多糖溶液的得率的影响。

1.2.3 响应面试验　参照陈灿辉等[26]对响应面的研究方法，结合单因素实验的最优值的结果，利用Design-Expert Visual 8.0.6.1软件设计最优值与最优值左右两边的各一个值，设计4因素3水平的进行响应面BBD分析实验，其4个主要因素为料水比、超声时间、超声温度、超声功率，按照每一个自变量最优值前一个值、最优值、最优值后一个值为水平分别以编码+1、0、−1表示，见表1。

表 1 响应面试验因素水平
Table 1 Response surface experimental factor and level
水平料液比A（mL/g）超声时间B（min）温度C（℃）超声功率D（W）−1254530195
0306040260
1357550325
第 44 卷第 8 期卢忠英，等：超声辅助提取苦丁茶多糖的工艺优化及其对黄嘌呤氧化酶抑制活性· 229 ·
1.2.4 苦丁茶多糖含量测定　
1.2.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制　用0.1 g纯度为HPLC≥98%的葡萄糖标准品，配制成1 L溶液，取0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 mL该溶液于8支比色管中并对其依序编号，取超纯水加入各试管内使其体积均为2 mL，向2~8号比色管中分别加入1 mL 5%苯酚和5 mL 98.08%浓硫酸，待各比色管加完后充分摇匀，水浴16 min，冷却至室温后，测量各比色管中溶液在波长490 nm条件下测定吸光度，作浓度-吸光度曲线，得标准曲线方程y=0.6196x+
0.007，R²=0.9997[27]。

1.2.4.2 苦丁茶多糖得率的计算　精密称取2.0 g苦丁茶粉末，加入蒸馏水在一定温度下超声提取，将提取液定容至200 mL，得样品溶液。

精密吸取2 mL 样品于试管中，加入8 mL无水乙醇，摇匀，醇沉24 h 后，在4000 r/min的速度下进行离心11 min，上清液回收，定容至10 mL，用Sevag法除蛋白[28]，取2 mL 上清液，按1.2.4.1操作，测得的吸光度代入标准曲线方程计算出苦丁茶多糖得率，Y=C×V/M。

其中Y为苦丁茶多糖得率，C为样品溶液浓度，V为配制液体积，M为苦丁茶质量。

1.2.5 苦丁茶多糖对XOD抑制作用　
1.2.5.1 酶活力测定　苦丁茶多糖对黄嘌呤氧化酶活力测定方法参考王亚楠等[29]方法并改进。

取试管将2.5 mL的磷酸缓冲液（pH7.5）加入其中，加入2.0 mL黄嘌呤溶液（1 mmol/L），温度恒定25 ℃，水浴20 min，加入0.5 mL酶溶液（0.05 U/mL），搅拌混匀，采用紫外分光光度计全波长扫描并记录反应产物尿酸的特征吸收峰。

用相同反应系统，当加入黄嘌呤氧化酶时作为计时起点，测定在特征吸收峰下特定时间内吸光度变化量，即尿酸生成量，每个样品操作3次，计算平均值。

以横坐标-反应时间，纵坐标-吸光度值作图，直线斜率表示反应速率（dA/min），当直线斜率越大时，则表示酶活力越强，dA为吸光度的增加值[29]。

1.2.5.2 苦丁茶多糖对XOD抑制活性的测定　按照余雄英等[30]方法稍作改进，在5 mL酶促反应系统中，按表2加样操作，在反应系统中逐一加入磷酸缓冲液（pH7.5）、黄嘌呤溶液（1 mmol/L）、苦丁茶多糖，加样结束后仍以“1.2.5.1”方法，测定在特定时间内尿酸的吸光度，以横坐标表示反应时间，纵坐标表示吸光度作图，然后其计算酶活力。

加入苦丁茶多糖，用A 表示酶活力，未加入苦丁茶多糖用B表示酶活力，苦丁茶多糖对XOD相对抑制率（%）=（1−A/B）×100[24]。

以空白组调零，测定样品组A；以阴性对照组调零，测定阳性对照组B。

按“1.2.5.1”方法，测定0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4、1.6 、1.8 mg/mL苦丁茶多糖对XOD的抑制率，将苦丁茶多糖与抑制率进行回归，根据回归方程计算半数抑制浓度（IC50）。

1.2.5.3 苦丁茶中黄酮类化合物对XOD抑制动力学实验　在酶促反应系统中，黄嘌呤溶液浓度恒定为1 mmol/L，加入苦丁茶多糖（0、0.2、0.4、0.8 mg/mL），测定不同浓度酶溶液在（0.025、0.05、0.10、0.15 U/mL）对酶活力的影响，即对反应速率的影响。

以酶浓度为横坐标，反应速率为纵坐标作图，通过得到的相关曲线即可判断苦丁茶多糖对XOD的抑制是否为可逆抑制[30]。

在酶促反应系统5 mL中，维持酶浓度（0.05 U/mL）恒定不变，逐一改变底物黄嘌呤溶液浓度（1.5、1.2、0.9、0.6 mmol/L），测苦丁茶多糖（0、0.2、0.4、0.8 mg/mL）对酶活力的抑制作用，即对反应速率的影响。

采取双倒数作图法（Lineweaver-Burk），横坐标-1/[S]（底物黄嘌呤溶液浓度的倒数），纵坐标-1/V（反应速率的倒数），判断苦丁茶多糖对XOD的抑制类型并用Dixon作图法计算抑制动力学常数K
i
[29]。

1.3　数据处理
单因素试验数据用SPSS 软件对实验数据进行ANOVA方差分析。

响应面优化试验数据采用Design-Expert V 8.0进行分析处理和Origin8.0作图。

2　结果与分析
2.1　苦丁茶多糖提取的单因素实验结果
2.1.1 料液比对苦丁茶多糖得率的影响　由图1可知，料液比在1:25~1:30 g/mL之间，苦丁茶多糖的得率不断上升，结果表明，料液比对苦丁茶多糖得率的影响较显著（P<0.05）。

料液比到1:30 g/mL时达到最大，而料液比1:30~1:40 g/mL之间，随着料液
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
得
率
(
%
)
料液比(g/mL)
1.5
1:201:25
e
d
a
b c
1:301:351:40
1.0
0.5
0.0
图 1 料液比对苦丁茶多糖得率的影响
Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on the yield of Ilex latifolia
Thunb. polysaccharide
注：不同小写字母代表 a=0.05 显著水平下，苦丁茶多糖得率之间具有显著性差异；图2~图4、图6同。

表 2 反应体系
Table 2 Reaction system
组别缓冲液（mL）苦丁茶多糖（mL）黄嘌呤（mL）XOD（mL）
空白组 2.60.420
样品组 2.20.420.4
阳性对照组 2.6020.4
阴性对照组3020
· 230 ·食品工业科技2023年 4 月
比上升又呈现下降趋势，表明苦丁茶多糖的得率在下降，因此确定选用料液比为1:30 g/mL 。

2.1.2 超声时间对苦丁茶多糖得率的影响　由图2
可知，提取时间在15~60 min 之间，随着超声时间的增长，苦丁茶多糖得率也逐渐增大，结果表明，超声时间对苦丁茶多糖得率的影响较显著（P <0.05），在60 min 时首先到达最高，60~75 min 段基本持平，表明60 min 基本提取完全，但在30 min 时达到第一个峰，30~45 min 之间上升趋势较小，分析可能随着超声时间延长导致其他物质溶出，进而影响多糖的得率
[18]
，所以60 min 为最佳。

65432得率 (%)
10
20
30
405060
70
80
e d
c
a
b
1
超声时间 (min)
图 2 超声时间对苦丁茶多糖得率的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic time on the yield of Ilex latifolia
Thunb. polysaccharide
2.1.3 超声温度对苦丁茶多糖得率的影响　由图3
可知，超声温度在20~40 ℃之间，苦丁茶多糖得率随超声温度的升高而增加，超声温度对苦丁茶多糖得率的影响较显著（P <0.05），且在40 ℃左右时达到最大，而在40~60 ℃段上反而呈下降趋势，分析可能是升高的温度和超声波的共同作用下，使得多糖的结构部分遭到破坏所致[26]，故选择40 ℃为最佳。

65432得率 (%)
20
30
405060
e
d
a
b
c
1超声温度 (℃)
图 3 超声温度对苦丁茶多糖的得率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the yield of Ilex
latifolia Thunb. polysaccharide
2.1.4 超声功率苦丁茶多糖的影响　由图4可知，超
声功率在195~260 W 之间时，随着超声功率的提高，苦丁茶多糖得率也随之升高，结果表明，超声功率对苦丁茶多糖得率有影响，但260~455 W 区间上，得率随功率的增大反而逐渐下降，分析可能是由于功率过大后，由超声波空化效应和机械波的影响，使得苦丁
茶多糖中结构发生变化或水解为单糖所致[31]。

65432得率 (%)
200
250
300350450
400
c
a
b
d
d
1超声功率 (W)
图 4 超声功率对苦丁茶多糖得率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of Ilex latifolia
Thunb. polysaccharide
2.2　响应面试验结果
2.2.1 响应面试验结果及方差分析　采用Design
Expert Visual 8.0.6.1软件对实验数据进行回归拟合分析，在软件下有10种模型可供选择，利用Modified 、Design Model 、Linear 、2FI 、Quadratic 、Cubic 等模型建模时均显示模型不显著，Mean 模型得不到预期想要的结果，而使用Quartic 、Fifth 、Sixth 模型均显示模型非常显著，按模型的建立越简单越好的原则，所以选择了Quartic 模型，实验结果见表3。

表 3 响应面试验结果
Table 3 Response surface experimental results
实验号因素
得率（%）料液比A 超声时间B
超声温度C
超声功率D
1−1−100 4.0221−100 3.893−1100 4.8641100 4.14500−1−1 2.836001−1 3.65700−11 4.2580011 5.029−100−1 4.3410100−1 2.9111−1001 4.86121001 4.65130−1−10 3.231401−10 3.86150−110 4.36160110 4.3217−10−10 5.121810−10 3.6219−1010 5.21201010 5.01210−10−1 2.7522010−1 3.15230−101 4.35240101 4.02250000 5.55260000 5.45270000 5.55280000 5.6229
5.75
第 44 卷 第 8 期卢忠英 ，等： 超声辅助提取苦丁茶多糖的工艺优化及其对黄嘌呤氧化酶抑制活性· 231 ·
根据Quartic 模型，得到苦丁茶多糖的得率与各因素变量的二次多项回归方程为：得率（%）=5.58−0.3492A+0.1458B+0.3883C+0.6267D−0.1475AB+0.325AC+0.305AD−0.1675BC−0.1825BD−0.0125CD−0.3141A 2−1.02B 2−0.5828C 2−1.05D 2
根据表4和表5可知，模型F 值为59.1，模型具有显著性，各变量对响应值影响的显著性的高低可用F 值大小进行判断，F 越大，则对应变量的显著性越高，工艺条件对多糖得率影响大小顺序D>C>A>B ，即超声功率>温度>料液比>时间。

模型决定性系数
R 2=0.9834，说明方程拟合度和可信度均良好，误差相对较小，响应值的变异系数CV 为3.7%，信噪比26.0802>4，故该模型是可靠的。

因此，此模型可用于苦丁茶多糖提取工艺的研究分析和预测。

此外，各因素A 、B 、C 、D 与AC 、AD 、A 2、B 2、C 2、D 2交互作用对响应值的影响均是极显著的（P <0.01），AB 、BC 、BD 交互作用对响应值的影响显著（P <0.05，P <0.01），CD 交互作用对响应值的影响不显著（P >0.05）。

响应曲线越陡，说明该因素对苦丁茶多糖的得率越显著，表现得越平滑，则表明不显著。

为考察各因素交互项对苦丁茶多糖得率的影响，从响应面3D 图（图5）比较可得，其中AC 、AD 曲线峰陡峭，对苦丁茶多糖得率的影响表现极显著，AB 、BD 、BC 的曲线峰较陡，对苦丁茶得率的影响显著，CD 曲线峰平缓，对苦丁茶多糖得率的影响不显著，与方差分析结果吻合。

2.2.2 确定最优条件　根据Design Expert Visual
8.0.6.1软件可得出最佳条件为料液比1:25 g/mL ，超声时间61.47 min ，超声温度39.3 ℃，超声功率263.19 W ，预测得率6.14%。

按实验操作进行适当调整为料液比1:25 g/mL ，超声时间为60 min ，超声温度40 ℃，超声功率260 W ，得出实际苦丁茶多糖得率为5.85%，RSD 为2.44%。

表 4 回归方差分析
Table 4 Regression variance analysis
方差源SS df 均方SM F 值Prob>F 显著性模型21.5114 1.5459.1<0.0001**A-料液比 1.461 1.4656.27<0.0001**B-时间0.255210.25529.820.0073**C-温度 1.811 1.8169.6<0.0001**D-功率 4.711 4.71181.25<0.0001**AB 0.08710.087 3.350.0887*AC 0.422510.422516.250.0012**AD 0.372110.372114.310.002**BC 0.112210.1122 4.320.0566*BD 0.133210.1332 5.120.04*CD 0.000610.00060.0240.879A 20.639910.639924.610.0002**B 2 6.81 6.8261.65<0.0001**C
2
2.21 2.284.75<0.0001**D 27.0917.09272.62<0.0001**
残差0.364140.026失拟项0.3149100.0315 2.56
0.1887
纯误差0.049140.0123
合计
21.87
28
表 5 可行性研究Table 5 Feasibility study
项目数值项目数值项目数值Std.Dev 0.1612变异系数
3.7Adj R 20.9667均值
4.36
R 2
0.9834
信噪比
26.0802
注“**”表示P <0.01，差异极显著，“*”表示P <0.5，差异显著。

5.55.0
4.54.0
3.54550
5560
65B : 超声时
间 (m i n )
得率 (%)
A :
料液比
(g /m L )707526283032
34
4.5
4.03.53.02.5
200
240
280
D : 超声功率 (W )
得率 (%)
A :
料液比
(g /m L )32026283032
34
4.54.03.53.02.52.0
30
3540
C : 超声温度 (℃)得率 (%)
A :
料液比
(g /m L )45
5026283032
34
200240280D : 超声功率 (W )3204.5
4.03.53.02.5
得率 (%)
B :
超声时间 (m i n )455055
60657075200240280D : 超声功率 (W )3203.0
2.52.01.0
1.5得率 (%)
C :
超
声
温度 (℃)3035404550
200240280D : 超声功率 (W )320C : 超
声
温度 (℃)3035404550
3.02.52.01.5
1.0
得率 (%)
图 5 交互作用对苦丁茶多糖得率影响的响应面图
Fig.5 Response surface diagram of interaction effect on the yield of Ilex latifolia Thunb. polysaccharide
· 232 ·食品工业科技
2023年 4 月
2.3　苦丁茶多糖对XOD 抑制作用2.
3.1 苦丁茶多糖对XOD 的抑制活性　由图6可
知，苦丁茶多糖质量浓度在0~0.6 mg/mL 时，抑制率随苦丁茶多糖质量浓度增加而呈升高趋势；在0.6~1.4 mg/mL 时，抑制率随着苦丁茶多糖质量浓度的升高呈现缓慢升高趋势；在苦丁茶多糖质量浓度大于1.4 mg/mL 时，抑制率变化趋于稳定。

利用SPSS 软件对数据进行回归分析，结果表明，苦丁茶多糖对XOD 活性影响较显著（P <0.05），得出苦丁茶多糖对XOD 的IC 50为1.28 mg/mL 。

605040301020抑制率 (%)
质量浓度 (mg/mL)
0.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.0
h
g
f
e
d
c
b
ab
a
图 6 不同质量浓度苦丁茶多糖对XOD 活力的影响Fig.6 Effect of Ilex latifolia Thunb. polysaccharides
concentration on XOD activity
2.3.2 苦丁茶多糖对XOD 抑制动力学分析　维持
底物黄嘌呤溶液质量浓度不变，在反应体系中分别加入不同质量浓度的苦丁茶多糖，当酶质量浓度变化时反应速率V 随着发生变化，如图7中直线经过原点，且随着苦丁茶多糖质量浓度增加反应速率随之减小，则说明苦丁茶多糖对XOD 抑制作用属于可逆抑制。

酶质量浓度 (μg/mL)
14
1210860 mg/mL 0.4 mg/mL 0.8 mg/mL 1.2 mg/mL
42
00.200.160.120.080.04
酶活力 (m o l /(L ·m i n ))
图 7 苦丁茶多糖对XOD 的抑制作用机制Fig.7 Inhibition mechanism of Ilex latifolia Thunb.
polysaccharides on XOD
在反应系统中，通过控制酶质量浓度恒定，依次
加入不同质量浓度的底物黄嘌呤溶液，测定加入不同质量浓度的苦丁茶多糖时对酶活力的影响情况。

用双倒数法作图，见图8直线相交于纵轴上的一点，随着苦丁茶多糖质量浓度的增大直线斜率逐渐增大，且纵轴的截距固定，不随苦丁茶多糖质量浓度的变化而发生变化，这些特点符合竞争性抑制，分析可能是苦
丁茶多糖结构中具有的大量-OH 、-COOH 和-C=O 以及含糖醛酸等官能团与底物黄嘌呤氧化酶底同时竞争酶活性中心的结合位点[18]，抑制与酶结合形成不能分解形成产物尿酸的可逆复合物[28]。

因此，苦丁茶多糖对XOD 抑制类型属于竞争性可逆抑制。

0.050.10
0.15
反应速率 (μm o l /(L ·m i n ))
0.40.30.20.10.50酶 (U/mL)
0 mg/mL
0.4 mg/mL 0.8 mg/mL
1.2 mg/mL
图 8 苦丁茶多糖对XOD 的抑制类型的测定
Fig.8 Determination of inhibition types of Ilex latifolia Thunb.
polysaccharides on XOD
采用Dixon 作图法求K i 。

参考李晶等[15]方法
对黄嘌呤溶液浓度0.8、1.0 mmol/L 两个反应系统进行测定，以苦丁茶多糖质量浓度为自变量，反应速率的倒数为因变量作图。

如图9，得到两条直线相交于一点，根据两直线的交点坐标计算求得抑制常数K i 值。

苦丁茶多糖对黄嘌呤氧化酶的K i 为0.62 mg/mL 。

−2
−1
126
5
437
反应速率倒数 (V −1)
14
10
18
6
底物浓度倒数 (S −1)
0 mg/mL 0.4 mg/mL 0.8 mg/mL
1.2 mg/mL
图 9 苦丁茶多糖对XOD 抑制常数的测定
Fig.9 Determination of XOD inhibition constants of Ilex
latifolia Thunb. polysaccharides
3　结论
通过单因素实验和响应面试验得出最佳提取条
件为料液比1:25 g/mL ，超声时间为61.47 min ，温度39 ℃，超声功率260 W 进行实验，得出实际得率为5.85%。

根据响应面方法得出的最优条件与预测得率之间与真实的得率之间的相差0.29 %，于淑池等[32]采用正交试验优化水提法提取苦丁茶多糖，提取条件在浸提温度为85 ℃，乙醇浓度为75%，浸提时间为1.5 h ，料液比为1:15条件下，得率为3.53%。

施思等[33]采用正交实验提取浸提温度90 ℃，沉淀时95%的乙醇与样品体积的比例为5:1，浸提次数1次，得到得率为4.71%。

ORSOR 等人采用水提法，
第 44 卷 第 8 期卢忠英 ，等： 超声辅助提取苦丁茶多糖的工艺优化及其对黄嘌呤氧化酶抑制活性· 233 ·
液料比5:1，索氏提取6 h后，得到得率为0.65%。

本文采用该方法优点是提取时间缩短，效率高。

本课题组研究苦丁茶多糖体外对XOD活性的影响，结果表明其对XOD抑制作用显著，IC50为1.28 mg/mL。

通过对苦丁茶多糖对XOD抑制作用动力学分析，苦丁茶多糖对XOD抑制作用类型属于竞争性可逆抑制，抑制动力学常数K i为0.62 mg/mL。

苦丁茶多糖由阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和果糖等组成,毒性低、副作用少，结合课题组研究结果表明苦丁茶多糖可作为潜在预防高尿酸血症的食品或保健品进行深入研究，以期能开发出具有更高效、安全的预防或治疗高尿酸血症和痛风病健康饮品提供参考依据，为苦丁茶的综合开发利用发展提供理论基础。

参考文献
［1］DALBETH N, MERRIMAN T R, STAMP L K, et al. Gout[J]. The lancet，2016，388（10055）：2039−2052.
［2］ WU Jie, QIU Ling, CHENG Xinqi, et al. Hyperuricemia and clustering of cardiovascular risk factors in the Chinese adult popula-tion[J]. Sci Rep，2017，7（1）：5456.
［3］GUPTA P K, BORO A K. Hyperuricemia and hypertension [J]. Indian Heart Journal，2017，69：S83.
［4］ WANG Tiezheng, CHUAN Tao, WANG Hao. Correlation be-tween hyperlipemia with hyperuricemia and coronary artery lesion [J]. Acta Medica Mediterranea，2019，35（1）：279−284.
［5］ KAPOOR N, GAMBHIR L, SAXENA S. Fungal endophytes as repository of xanthine oxidase inhibitor[J]. Indian Drugs，2019，56（3）：7−11.
［6］KAMEL E M, AHMED N A, EL-BASSUONY A A, et al. Xanthine oxidase inhibitory activity of Euphorbia peplus L. pheno-lics[J]. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening，2022，25（7）：1336−1344.
［7］ RØDEVAND E, SLETVOLD O, KVANDE K T. Side effects off allopurinol[J]. Tidsskrift for den Norske laegeforening: Tidss-krift for praktisk medicin, ny raekke，2004，124（20）：2618−2619.［8］ WAN Yin, QIAN Jin, LI Yizhen, et al. Inhibitory mechanism of xanthine oxidase activity by caffeoylquinic acids in vitro[J]. In-ternational Journal of Biological Macromolecules，2021（4）：843−856.
［9］ KUMAR S, PAGAR A D, AHMAD F, et al. Xanthine oxidase inhibitors from an endophytic fungus Lasiodiplodia pseudotheobro-mae[J]. Bioorganic Chemistry，2019，87：851−856.
［10］韦晓洁, 银慧慧, 孟菲, 等. 苦丁茶有效成分及药理活性的研究进展[J]. 中国医药报，2017，14（24）：62−65. ［WEI Xiaojie, YIN Huihui, MENG Fei, et al. Research progress on the effective constituents and pharmacological activities of Ilex kudingcha C. J. Tseng[J]. China Medical Herald，2017，14（24）：62−65.］
［11］FEN Ruibing, FAN Chunlin, LIU Qing, et al. Crude triter-penoid saponins from Ilex latifolia(Da Ye Dong Qing) ameliorate lipid accumulation by inhibiting SREBP expression via activation of AMPK in a non-alcoholic fatty liver disease model[J]. Chinese Medicine，2015，10（1）：23−24.［12］WU Xuli, WANG Wenpu, ZHU Tian, et al. Phenylpro-panoid glycoside inhibition of pepsin, trypsin and α-chymotrypsin enzyme activity in Kudingcha leaves from Ligustrum purpurascens [J]. Food Res Int，2013，54（2）：1376−1382.
［13］ YI Ruikun, ZHANG Jing, SUN Peng, et al. Protective effects of Kuding Tea (Ilex Kudingcha C. J. Tseng) polyphenols on UVB-Induced skin aging in SKH1 hairless mice[J]. Molecules，2019，24（6）：338−428.
［14］蔡鹃, 黄敏桃, 黄云峰, 等. 广西苦丁茶不同活性部位抑菌活性研究[J]. 中成药，2014，36（1）：198−201. ［CAI Juan, HUANG Mintao, HUANG Yunfeng, et al. Research on antibacterial of differ-ent active parts of Guangxi Kudingcha[J]. Chinese Triditional Patent Medicine，2014，36（1）：198−201.］
［15］李晶, 姜丽丽, 李沐轩, 等. 黄芪多糖对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用[J]. 食品与生物技术学报，2021，40（10）：16−20. ［LI Jing, JIANG Lili, LI Muxuan, et al. Inhibitory Effects of Astragalus polysaccharide on activity of xanthine oxidase[J]. Food Science and Biotechnology，2021，40（10）：16−20.］
［16］ KAKUMU Y, NGUYEN T M T, YAMAUCHI K, et al. New benzoic acid and caffeoyl derivatives with anti-inflammatory activi-ties isolated from leaves of Ilex kaushue[J]. Natural Product Re-search，2022，36（12）：3013−3023.
［17］胡婷. 苦丁茶中有效成分的分离纯化、鉴定及其活性研究[D]. 广州: 华南理工大学, 2013. ［HU Ting. Study on isolation and identification of Ilex latifolia thunb and its bioactivities [D]. Guangzhou : South China University of Technology, 2013.］［18］张现珠, 王潇潇, 陈贵杰等. 大叶苦丁茶多糖的研究进展[J]. 中国茶叶加工，2022（1）：49−57. ［ZHANG Xianzhu, WANG Xiaoxiao, CHEN Guijie, et al. Research progress in large leaf Kud-ingcha polysaccharides[J]. Chinese Tea Processing，2022（1）：49−57.］
［19］SONG Zhiqin, HAN Xue, YANG Pingfei, et al.Optimiza-tion of extraction technique of polysaccharides of Dendrobium fim-briatum by response surface methodology[J]. The Food Industry，2022，43（2）：71−75.
［20］王家辉, 刘杉杉, 张鑫, 等. 牛蒡不同部位多糖的抗氧化与抗凝血活性研究[J]. 食品工业科技，2020，41（6）：305−310. ［WANG Jiahui, LIU Shanshan, ZHANG Xing, et al. Antioxidant and antico-agulant activities of polysaccharides extracted from different parts of Arctium lappa L.[J]. Science and Technology of Food Industry，2020，41（6）：305−310.］
［21］尹明松, 丁贺辉, 潘飞兵, 等. 响应面优化超声辅助双水相提取槟榔多糖及抗氧化活性研究[J]. 食品研究与开发，2021，42（19）：163−170. ［YIN Mingsong, DING Hehui, PAN Feibing, et al. Optimization of ultrasonic-assisted aqueous two-phase extraction of Areca catechu L. polysaccharide using response surface design and assessment of its antioxidant activities[J]. Food Research and Development，2021，42（19）：163−170.］
［22］杨茂会, 周欣, 谯政文, 等. 黄精多糖提取分离纯化及生物活性研究进展[J]. 食品工业科技，2022，43（12）：407−416. ［YANG Maohui, ZHOU Xin, QIAO Zhengwen, et al. Recent advances in Polygonatum polysaccharides: Extraction, isolation, purification and bioactivities[J]. Science and Technology of Food Industry，2022，
· 234 ·食品工业科技2023年 4 月
43（12）：407−416.］
［23］ YOON I S, CHO S S. Effects of lobetyolin on xanthine oxi-dase activity in vitro and in vivo: Weak and mixed inhibition[J]. Natural Product Research，2021，35（10）：1667−1670.
［24］姚兰. 大叶冬青化学成分及其生物活性研究[D]. 长春: 吉林农业大学, 2018. ［YAO Lan. Studies on the chemical compo-nents of Ilex latifolia Thunb. and its bioactivities[D]. Changchun: Jilin Agricultural University, 2018.］
［25］魏晴, 梁珊珊, 孙庆文. 响应面法优化大果木姜子多糖提取工艺及抗氧化研究[J]. 食品研究与开发，2021，42（23）：41−46.［WEI Qing, LIANG Shanshan, SUN Qingwen. Optimization of ex-traction process and antioxidant activity of polysaccharides from Cinnamomum migao H. W. Li by response surface methodology[J]. Food Research and Development，2021，42（23）：41−46.］
［26］陈灿辉, 林彤, 江文韬, 等. 响应面法优化笋头多糖微波-超声波辅助提取工艺[J]. 食品工业科技，2020，41（16）：201−206, 291. ［CHEN Chanhui, LIN Tong, JIANG Wentao, et al. Optimiza-tion of microwave-ultrasonic assisted extraction of polysaccharides from basal part of bamboo shoot by response surface methodology [J]. Science and Technology of Food Industry，2020，41（16）：201−206, 291.］
［27］温思萌, 王亚冬, 昝立峰, 等. 响应面优化酶法提取茯苓多糖工艺[J]. 中国食品添加剂，2021，32（8）：36−43. ［WEN Simeng, WANG Yading, CHU Lifeng, et al. Optimization of enzymatic ex-traction of pachyman from Poria cocos by response surface method-ology[J]. China Food Additives，2021，32（8）：36−43.］
［28］孙悦, 何莲芝, 苏卓文. 超声辅助低共熔溶剂提取甘草多糖的研究[J]. 食品研究与开发，2021，42（2）：84−91. ［SUN Yue, HE Lianzhi, SU Zhuowen. Ultrasonic-assisted eutectic solvent extrac-
tion of glycyrrhiza polysaccharide[J]. Food Research and Develop-ment，2021，42（2）：84−91.］
［29］王亚楠, 张志军, 李会珍. 紫苏叶提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用[J]. 中成药，2020，42（2）：462−265. ［WANG Yanan, ZHANG Zhijun, LI Huizhen. Inhibitory effect of perilla leaf extract on xanthine oxidase[J]. Chinese Traditional Patent Medicine，2020，42（2）：462−265.］
［30］余雄英, 廖永翠, 潘惠, 等. 肉桂醛缩氨基脲对黄嘌呤氧化酶的抑制作用研究[J]. 食品与生物技术学报，2021，40（5）：88−92.［YU Xiongying, LIAO Yongcui, PAN Hui, et al. Inhibitory effects of cinnamic aldehyde semicarbazone on activity of xanthine[J]. Food Science and Biotechnology，2021，40（5）：88−92.］
［31］刘星宇, 廖艺, 王壹, 等. 超声波联用技术在植物活性成分提取中的应用研究进展[J]. 食品与发酵工业，2022，48（14）：319−327. ［LIU Xingyu, LIAO Yi, WANG YI, et al. Research progress on application of ultrasound hyphenated technique in extraction of active phytochemicals[J]. Food and Fermentation Industries，2022，48（14）：319−327.］
［32］于淑池, 陈文, 杭瑜瑜, 等. 海南苦丁茶多糖的降血糖功效评价[J]. 食品研究与开发，2017，38（4）：161−164. ［YU Shuchi, CHEN Wen, HANG Yuyu, et al. An evaluation on the hypo-glycemic efficacy of polysaccharide from Hainan Kudingtea[J]. Food Research and Development，2017，38（4）：161−164.］
［33］施思, 陈炼红, 伍红. 苦丁茶多糖提取工艺条件的优化研究[J]. 西南民族大学学报:自然科学版，2010，36（6）：983−987.［SHI Si, CHEN Lianhong, WU Hong. Studies on optimizing tech-nique of tea-polysaccharide extraction in Kudingcha[J]. Journal of Southwest University for Nationalities:Natural Science Edition，2010，36（6）：983−987.］
第 44 卷第 8 期卢忠英，等：超声辅助提取苦丁茶多糖的工艺优化及其对黄嘌呤氧化酶抑制活性· 235 ·。