羌活水提物预先给药对CCI大鼠神经病理性疼痛的预防作用及机制研究

•研究报告•
羌活水提物预先给药对CCI大鼠神经病理性
疼痛的预防作用及机制研究！
谢恒韬王娟贾一帆贾强潘侠王龙
(武汉大学人民医院，湖北武汉々SO!!%)
中图分类号文献标志码:A文章编号&1004-745X(2019)03-0414-04
d〇i：1O.3969/j.issn.1OO4-745X.2O19.O3.O1O
【摘要】目的探讨羌活水提物预先给药对神经慢性结扎损伤（CCI)大鼠神经病理性疼痛的预防作用及机制
研究。

方法5O SD大鼠 机 分为假手术组、模型组、羌活低剂组、羌活中 组和羌活高剂
组，制备CCI大鼠模型，假手术组 神经不 。

羌活剂量组给予不同剂羌活水提物，假手术
组和型组给理水。

术 14d，大鼠进行机痛，大L4-L6 ，
比较不同组大鼠脊髓组织中 神经 P2X4受体(P2X4:)、-k B(NF-k B)、-1"
(IL-1")和肿瘤坏死因子-a(TNF-a)水平。

结果与假手术组比较，术后其余各组机械痛 ，脊髓组
中P2X4:、NF-k B、IL-1"和TNF-# 水平均增高，差异具有统 （！<0.O5);与模型组 ，术后羌
活各剂量组机械痛 ，脊髓组织中P2X4:、NF-k B、IL-1"和TNF-# 水 ，差异有统计
学意义(！<O.O5);羌活各剂组机械痛阈随羌活剂量的，脊髓组织中P2X4:、NF-k B、IL-1"和
TNF-# 水 羌活剂的，差异有统（！<O.O5)。

结论羌活水提物 大鼠
神经病理性疼痛，其作用机制 制 中P2X4:的，NF-k B 水平有。

【关键词】羌活水提物CCI大鼠神经病理性疼痛P2X4: NF-k B
Preventive Effect and Mechanism of Pre-administration of Rhizoma Notopterygii Aqueous Extract on
Neuropathic Pain in CCI Rats Xie Hengtao，Wang Juan，Jia Yifan，et al. People's Hospital of Wuhan Uni­
versity ， Hubei ， Wuhan 43O223，China.
【Abstract】Objective:Toinvestigatethepreventiveeffectandmechanismofpre-administrationofrhizomano-
topterygii aqueous extract on neuropathic pain in chronic constrictive injury (CCI)rats. Methods：5O SD rats
were randomly divided into the sham operation group，the model group，low-dose group，middle-dose group and
high-dose group. The sham operation group only had its nerves exposed. The different dose groups received rhi­
zoma notopterygii aqueous extract with difference concentration，while the sham operation group and the model
group received the normal saline. On the postoperative 14 d，the mechanical withdrawal threshold was measured.
P2X4R，NF-k B，IL-1" and TNF-a levels at the spinal cord(L4~L6)were detected and compared. Results:Com­
pared with the sham-operated group，the mechanical pain threshold of other groups decreased，and the expression
levels of P2X4R，NF-k B，IL-1" and TNF-a in spinal cord tissue were increased，with statistical significance (P<
O.O5). Compared with the model group，the mechanical pain threshold of other groups increased，and the expres­
sion levels of P2X4R，NF-k B，IL-1" and TNF-a in spinal cord tissue were decreased，with statistical significance
(P< O.O5). The mechanical pain threshold increased with dose，and the expression levels of P2X4R，NF-k B，IL-
1" and TNF-a in spinal cord decreased with dose，with statistical significance (P< O.O5). Conclusion：Rhizoma
notopterygii aqueous extract can effectively ameliorate the neuropathic pain in rats，whose mechanism may be re­
lated to the inhibition of P2X4R expression in the spinal cord and the decrease of NF-k B and pro-inflammatory
factors.
【Key words】Rhizoma notopterygii aqueous extract;CCI rat;Neuropathic pain;Pro-inflammatory factor;P2X4R;
NF-k B
神经病理性疼痛是一种由神经系统原发性损害和!基金项目：湖北省自然科学基金资助项目（2015CFB133)功能障碍所激发或引起的疼痛，其临床特征表现为痛 觉过敏、自发性疼痛、疼痛和感觉异常。

研究显示，有超 过66的人群患有不同程度的神经病理性疼痛[1%。

目前，
神经病理性疼痛的发病机制尚不清楚，对阿片类或非 甾体类抗炎药物不敏感，临床治疗效果不佳。

因此，临 床迫切需要新的治疗4P P药物[!]。

从中医药关于镇痛 的处方中寻找新的治疗药物为神经病理性疼痛的治疗 提供了新的思路。

《汤液本草》记载中显示，“羌活气雄，头疼、肢体通，全身疼痛，非此不能除，’[3]。

研究羌活的 镇痛机制可以为神经理性疼痛的治疗要。

研究 为，神经 理性疼痛 于神经起机体免疫反应激活，导炎症因子
起[4]。

三叉神经 能P2X4受体（P2X4R)的起的痛 神经 神经性疼痛的要
因[5]。

核转录因子k B(N F-k B)了机体炎症反应、应 理能，炎症因子#
素-1"(IL-1")、-6(IL-6)因子-#(T N F-a)] 的 關。

因此，本研究
通制神经性（C C I)，不的羌 提物 ，羌 治疗神经
理性疼痛的机制。

1材料与方法
1.1实验动物健康雄性S D大鼠50只，体质量180-220 g，医 物中，
可证号：SC X K(鲁）2012-0002，物 . 2007000577866。

为 22-24 !、相对湿度为40G-70%、噪音！50 d B的S P F环境中自由进 食和饮水，控制 昼夜循 （12h A2h)，适应性
喂 1周 。

1.2试药与仪器1)药物：羌活购自成都中医药大学 中药研究所，取燥羌根茎60!烤箱中烘烤，前 后两次称重恒定 羌活用粉碎机粉碎，称取500 g 入烧杯中，加入8倍体积的煎煮2次，每次1h，滤液 浓缩至500 m L，使羌的药浓为
1g/m L，滤除菌，-20!冰箱保存备用。

戊巴比妥钠 上海上药新亚药业有限公司。

2)试.抗 P2X4R和N F-k B抗体购自美国S an ta C r u z公司；辣根 过氧化物酶H R P标记亲和纯 羊抗鼠I g S二抗、：抗S A D P H单克隆抗体武汉艾美捷技有限公司；蛋白抽提试盒武汉博士德物工程有限公司；E L I S A试盒欣博盛物技有限公司。

3)仪器：机械测痛仪购自美国N orth C oast M e d ic a l公司；电子天肀 上海 公司；电！制试盒、S D S-P A S E蛋白上 液 天生物科技有限公司；B I0-R A D垂直电仪购自美国BD 公司；凝胶成像仪购自美国U V P公司；H B S-1096B酶 标仪 南京德铁 有限公司。

1.3分组及给药根据为5组(假手术组、、羌 、羌中和羌 ），每 10只。

羌 、中、
前 30 m in和 1、2d3d 5 m L注器 为2.5、5、10g/k g羌 提物，假和 理 。

1.4模型制备CCI的制备根据B e n­n ett等[9]的方 。

食12h戊巴比妥钠(300 m g/k g)定于 上，对
和 ，中部切 ，性 ，神经，神经 子神经和周 ，神经 4.0
神经 4 ，每 1m m，要 不 神经 供，理 清 切 。

神经不 。

20 U
，使 3 d。

1.5标本采集与检测1)机械痛阈测定：分别在术前 1d14 d械测痛仪测定。

于有机玻璃箱中，适应 V on F r e y纤维刺激
3、4 ，有 为 性，
为 性。

以性反应的 克 为 的 械痛 。

成测试，，取 膨 L4-L6段，理 ，-80!保存 ，关指标的检测。

2)酶联免疫吸附（E L IS A)检测
织中IL-1"和T N F-a:取适 ，加入预冷磷酸 液，制成匀浆，，吸取上清 。

按E L I S A试盒说明书操，制标准曲计算 IL-1"和 T N F-a表达。

3)W e ste m b lottin g法检测脊髓 中P2X4R和N F-k B蛋白表达水肀：取适
，约50 m g，用预冷磷酸 液涤 2 ，研碎根据 加人应蛋抽提试，冰浴2 h;
取上清，每管加人1/5体积的5x B u ffer i
性，-80!保存 。

电、切/孵育P2X4R、N F-k B和S A D P H-抗（1:1 000)，4 !过夜，孵育山羊抗
I g S二抗（1$1 500)，室温下孵育2 h，成像系统集图像析。

1.6统计学处理应S P S S19.0统计软件。

计量资料以（!!"）示，单因素方差析判，间两两比较用S N K-#检验。

$<0.05为差异有统计学 意义。

2结果
2.1各组手术后机械痛阈的比较见表1。

各组大鼠
前械痛比较差异统计意义($>0.05)。

比较，其余 械痛 降，差异具有统计学意义($< 0.05); 比较，羌-剂械痛 增加，差异具有统计学意义($<0.05);羌 械痛羌的增加增加，差异具有统计学意义($< 0.05 )。

表1各组手术前后机械痛阈比较（g,#±$)
组另1」术术后
假手术组1022.42±4.6124.39±3.25
模型组1024.98±6.179.80±3.48J
羌活低剂量组1023.64±5.8414.95±2.92J#
羌活中剂量组1025.60±5.7816.31±4.26M#A
羌活高剂量组1024.15±3.8019.27±2.99*K A i 与假手术组同期比较，#!<0.05;与模型组同期比较,#!<0.05; 与羌活低剂量组同期比较，！！< 0.05;与羌活中剂量组同期比较，"!<0.05。

下同
2.2 各组脊髓组织中P2X4R和NF-k B蛋白表达水平比较见表2和图1。

与假手术组比较，其余各组脊髓组织中P2X4R和NF-k B蛋白表达水@均增高，差 异具有统计学意义(！< 0.05);与模型组比较，羌活各剂量组脊髓组织中P2X4R和NF-k B蛋白表达水@均降低，差异具有统计学意义(！< 0.05);羌活各剂量组脊髓组织中P2X4R和NF-k B蛋白表达水@随羌活剂量的增加而降低，差异具有统计学意义(！<0.05)。

表2各组脊髓组织中P2X4R和NF-k B蛋白表达水平比较(#±s)组另1」P2X4R NF-k B
假手术组100.17±0.030.14±0.05
模型组100.68±0.07J0.57±0.12J
羌活低剂量组100.54±0.10J#0.45±0.05J#
羌活中剂量组100.40±0.08JK A0.36±0.05JK A 羌活高剂量组100.32±0.03J#A A0.29±0.04J#A A
A B C D E
G A D P H.....'I.r n n'i r......一-—-
A.假手术组;
B.模型组；
C.羌活低剂量组；
D.羌活中剂量组；
E.羌活高剂量组
图1各组脊髓组织中P2X4R和NF-k B蛋白表达
2.3 各组脊髓组织中IL-1"和T N F-#水平比较见 表3。

与假手术组比较，其余各组脊髓组织中IL-1" 和T N F-#?@均增高，差异具有统计学意义（！< 0.05);与模型组比较，羌活各剂量组脊髓组织中IL-1" 和T N F-#?@均降低，差异具有统计学意义（！< 0.05);羌活各剂量组脊髓组织中IL-1"和T N F-#水 @随羌活剂量的增加而降低，差异具有统计学意义(!< 0.05)。

3讨论
三磷酸腺苷（A T P)是机体主要的能量物质和神
表3 各组脊髓组织中IL-1"和TNF-#水平比较（ng/L，#±$ )组另1」IL-1"tnf-#
假手术组1022.42±4.61154,61±16,52
模型组1078.49±10.70J369.43±19.53J
羌活低剂量组1062.64±8.26J#293.18±33.92J#
羌活中剂量组1050.66±6.15J#A267.50±20.67J#A 羌活高剂量组1034.16±4.92JKA"219.83±32.09J#A"
经递质，其主要通过嘌呤受体参与神经系统信息的传递[10]。

嘌呤受体(P)分为P1和P2受体两大类，P2受体又分为P2X和P2Y两类。

P2X受体在Na B和Ca2B内流 过程中，P2X
P2X1-7R共7种亚型[11]。

P2X受体参与了伤害信息的传递，为A T P的 位点，在突、后均有表达，伤害，机体ATP，P2X受体激活，通 ，[12]。

，P2X4R 和P2X7R参与了神经病理性疼痛[13]。

质 分为质 和 型 质 两种类
型[1]，分大脑和脊髓，过70%中神经，为质，在神经系统的过程中要
[14]。

P2X4R在、神经和脊髓的质 中
分 ，在 质 中表达。

神经伤，质 大量ATP，活 质 内P2X4R，使其表达，Ca2G内流，蛋白 C，NF-k B表达增磷酸化，质细胞的增加，使机体异[15]。

，CCI大模型中
P2X4R表达水@增高，P2X4R的表达后，能显著经的 [16]。

，羌活水物能降低P2X4R的表达水@，从而达神经[性疼的 ，与 。

大 脊髓内注入P2X4R，大 异[17]。

t 表明，P2X4R信的在 神经过症的机 中 。

NF-k B在神经系统和 中具有独特的作用。

当外周神经伤，受神经NF-k B被活，导NF-k B的转位腺苷酸活化蛋白激酶(M API)信通路活，各类炎症因的，同，这些的炎症因又介质 活 炎症因子，成一个炎症级联反应，诱导中神经系统敏化，慢 的产生[18]。

TNF-#是炎症后最早的细胞因子，主要由巨噬和淋巴细胞产生，当他们过
度表达介炎症因子趋而剧瀑样炎症反应，最终组织伤[19U l-1"是体内最强的炎
症因子，是TNF-#级联反应的产物，认为，IL-1"
分泌增加与过有关，在机械域过的
产生中要作用[20]。

，给予羌活水物后，C C I大鼠的NF-k B、TNF-#和IL-1"表达水@
都
有程的。

,脊髓中P2X4R的表达，降低NF-k B、IL-1P和T N F-a水平，从而缓解大鼠
,药用 的
的。

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