双分子荧光互补试验研究水稻NH1家族蛋白之间相互作用

双分子荧光互补试验研究水稻NH1家族蛋白之间相互作用白薇;孙海莲;Mawsheng Chern;Randy Ruan;Pam Ronald;樊明寿
【摘要】NPR1 (Non-expresser of pathogenesis related genes 1 ) is the master regulator of salicylic acid-mediated systemic acquired resistance. Over-expression of Arabidopsis NPR1 and rice NH1 (NPR1
homologl )/OsNPR1 in rice results in enhanced resistance. There are four rice NPR1-paralogs in the rice genome,they are family members of NH1. Protein-protein interaction between members of NH1 family were studied in vivo by bimolecular fluorescence eomplementation assay( BiFC ,or split YFP). NH1, NH3, NH4, and NH5 all can interact with itself to generate fluorescence signals. They can also interact with other members in the family. But NH2 has no interaction with anyone.%NPR1(Non-expresser of pathogenesis related genes 1)是水杨酸(Salicilic acid,SA)介导的系统获得抗性(Systemic aquired resistance,SAR)的关键调控因子,在水稻中过量表达拟南芥NPR1和水稻NH1/OsNPR1(NPR1 homo1ogue 1)(NPR1的同源物)可增强抗病性.水稻基因组中还有4个NPR1旁系同源物(Paralog),为NH1的家族蛋白.本试验利用双分子荧光互补技术(Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC,or split YFP)研究了水稻NH1家族蛋白之间在活体内的相互作用,发现除NH2外,NH1、NH3、NH4和NH5都会和自身的蛋白互作,产生荧光信号,并且它们还会和家族成员的其他蛋白相互结合产生荧光信号.
【期刊名称】《华北农学报》
【年(卷),期】2011(026)002
【总页数】5页(P30-34)
【关键词】水稻;NH1家族蛋白;双分子荧光互补试验;蛋白互作
【作者】白薇;孙海莲;Mawsheng Chern;Randy Ruan;Pam Ronald;樊明寿
【作者单位】内蒙古农业大学生命科学学院,内蒙古呼和浩特010018;中国科学院
内蒙古草业研究中心,内蒙古呼和浩特010031;Department of Plant Pathology,University of California,Davis,CA,A;Department of Plant Pathology,University of California,Davis,CA,A;Department of Plant Pathology,University of California,Davis,CA,A;内蒙古农业大学农学院,内蒙古呼和浩特010018
【正文语种】中文
【中图分类】S511
自然界中，植物在其生命周期的绝大部分时间里都暴露在微生物中，植物在进化过程中发展出很多策略来对付微生物的侵染。

植物的系统获得抗性，是指当植物局部受病原菌侵染后,可诱导植株远端未侵染部位产生对后续多种病原菌侵染表现出的
抗性[1，3]。

SAR可由能够引起组织快死的大多数病原菌诱发产生，获得的抗性
是广谱的，对包括病毒、细菌、卵菌和真菌均有抗性。

此外，SAR是长久的保护，可持续几周到一个月，有时甚至是整个季节[4,5]。

而且不光是获得对病原菌的抗性，还常常获得对昆虫的抗性[6]。

SAR的执行有赖于各种植物激素，包括水杨酸、茉莉酸、乙烯(Ethylene，ET)和脱落酸等[7-10]。

NPR1又叫NIM1和SAI1基因，是拟南芥中SA介导的SAR的关键调控因子[11-16]。

NPR1编码的蛋白具有一个双重核定位序列(Bipartite nuclear localization
sequence)，和两个蛋白与蛋白互作结构域：锚蛋白重复序列结构域(Ankyrin repeat domain)和BTB/POZ结构域[17]。

NPR1蛋白的细胞核定位对其功能是必需的[18]，锚蛋白结构域对与TGA转录因子的互作是必需的[19,20],BTB/POZ结
构域与TGA2的抑制结构域结合，起到消除其功能的作用[21]。

在非诱导状态下NPR1蛋白通过分子间二硫键形成寡聚体，被排斥于细胞核外。

一旦SAR被诱导，SA的积累使细胞内还原势增加，NPR1寡聚体中的二硫键被还原形成单体，并通
过位于NPR1蛋白C末端的核定位序列的作用，使NPR1单体在细胞核内积累，
从而激活下游PR基因表达[22]。

Chern等2005年分离并鉴定了水稻中NPR1的直系同源物
(Ortholog):NH1(NPR1 homologue 1)/OsNPR1，NH1含有593个氨基酸，与NPR1的同源性为49%。

也具有同NPR1一样的两个蛋白与蛋白互作结构域：锚
蛋白重复序列结构域和BTB/POZ结构域。

过量表达NH1的转基因水稻表现出对Xoo很强的抗性，而且可以自发激活防御基因的表达[23]。

水稻中除NH1以外，还有4个NPR1的旁系同源物，为NH1的家族蛋白。

双分子荧光互补试验已经被成功的应用于检测植物细胞中很多蛋白与蛋白之间的相互作用[24,25]。

该技术利用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)及其突
变体的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。

如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光。

在荧光显微镜下，就能直接观察到两个目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等。

本试验旨在利用双分子荧光互补试验研究NH1家族蛋白之间活体内的相互作用，为进一步揭开其在细胞内的作用机制奠定基础。

1 材料和方法
1.1 试验材料
以粳稻品种Kitaake(Kit)为试验材料，将种子萌发后，转移到一次性塑料杯的土壤里，黑暗下28℃培养，10 d后取水稻幼苗用于原生质体制备。

1.2 基因克隆和质粒载体构建
NH1用引物NH1-TAP1(CACCGAGCCGCCGACCAGCCACGTCA)和NH1-
TAP2(GCAATGGTGTTCATCTCCTTGGT)扩增。

NH2用引物NH2-
TAP1(CACCCCGGCGCGTAGCGCGGTGGTGGT)和NH2-
TAP2(CTGTCATTTCTTTGCAACCTTGG)扩增。

NH3用引物NH3-
TAP1(CACCGAGA CGTCCACCATAAGCTTCTC)和NH3-TAP3(ACTGC AGATTAGACTTAACTGCTG)扩增。

NH4用引物NH4-
TAP3(CACCGAGGAAACCCTCAAGTCGCTGTC CA)和NH4-TAP2(CCACACCCC CTTTCGTCGTCAG)扩增。

NH5用引物NH5-
TAP3(CACCAGCTCCGAGGACTCGCTCAAATCCT)和NH5-
TAP2(TCAACACGGCTAGTAGAAGAGAAG)扩增。

每个扩增产物都被克隆到pENTR-D载体，再分别重组到Gateway兼容的pY736和pY735载体,得到与YFPN和YFPC的融合蛋白，用于split YFP试验。

1.3 水稻原生质体制备
生长10 d的水稻幼苗，取其叶片，切成1 mm的碎片，迅速放入含1.5%纤维素酶和0.75%离析酶的溶液中，使叶片全部浸没在溶液中。

放于振荡器上28℃黑暗中孵育4 h。

将溶液用35 μm的纱网过滤，用2 mmol/L MES(pH5.7)的缓冲液洗2次后重悬于4 mmol/L MES(pH5.7)缓冲液中。

取8 μL用血球计数器在显微镜下检查原生质体浓度。

试验中所用浓度为1～5×106 cells/mL。

1.4 PEG转化
取100 μL 1×106～5×106 cells/mL的原生质体，与5 μg DNA混合，加入110 μL 40% PEG，室温孵育15 min后用10倍体积的W5清洗2遍，用合适体积的5 mmol/L MES(pH5.7)孵育缓冲液重溶，28℃孵育超过20 h。

1.5 双分子荧光互补试验
NH1-NH5 cDNA被分别重组到与Gateway兼容的pY736载体产生YN:NH1-NH5蛋白，同样地，NH1-NH5 cDNA再被分别重组到与Gateway兼容的
pY735载体产生YC:NH1-NH5融合蛋白。

用荧光显微镜Axiovert 25(Zeiss)检测YFP，激发光500/25 nm，发射光535/30 nm，滤光镜46HE。

图像用照相机Retiga 2000R拍摄，图像没有经过人工加色处理。

2 结果与分析
2.1 NH1家族蛋白
水稻中存在有5个NPR1类蛋白，分别是NH1、NH2、NH3、NH4和NH5，它们在基因组中由6个基因编码(TIGR gene ID Os01g09800、Os01g56200、
Os03g46440、Os01g72020、Os11g04600、Os12g04410)，称为NH1家族蛋白。

其中NH5蛋白由两个重复基因Os11g04600和Os12g04410编码，最近证明这两个重复基因是由于染色体片段重复导致的。

根据Blast搜索结果，水稻的5个NPR1类蛋白也可分为3个亚组：NH1第一亚组，NH2和NH3第二亚组，NH4和NH5为第三亚组。

其中NH1的序列最为独特，其他几个蛋白与NH1的同源性分别为：NH2 43%、NH3 43%、NH4 31%、NH5 33%(图1)。

水稻的NH1家族的5个蛋白基于TIGR的注解并经分离的cDNA克隆确认，序列用BlastP进行比对，氨基酸同源性的百分比是分别与NH1的比值得来。

Sequences of the five rice NH1 family proteins are based on TIGR annotations and confirmed by isolated cDNA clones.Sequences are aligned
using BlastP.The percentage of amino acid(aa) identity was calculated by comparing individual protein to NH1,respectively.
图1 水稻NH1家族蛋白系统进化树
Fig.1 A phylogenic tree of rice NH1 family proteins
2.2 YFP融合蛋白载体的构建
将NH1及其家族成员的cDNA分别融合到黄色荧光蛋白(Yellow fluorescence protein,YFP)N端一半(YFPN or YN)和C端一半(YFPC or YC)的C末端，由35 S 启动子驱动，构建融合表达载体，见图2。

图2 NH1家族成员与YFPN和YFPC的融合表达载体Fig.2 Constructs of fusion expression for NH1 family members and YFPN or YFPC
2.3 NH1家族蛋白自身的相互作用
制备水稻原生质体，在显微镜下检查时，健康的原生质体是圆的，与其他细胞分离开，细胞膜是完整的。

将构建好的融合表达载体，转染水稻原生质体，进行双分子荧光互补试验，在细胞内活体检测它们的相互作用。

NH1与家族成员的互作见图
3所示，在NH1与NH1、NH3和NH4的组合中，都观察到有很强的YFP荧光
信号，说明它们之间可以彼此相互结合。

在NH1与NH2和NH5的组合中也观
察到有荧光信号，但比起前面的信号要弱一些，说明它们之间的结合要相对弱一些。

NH2与各个成员之间的组合没有观察到荧光信号。

NH3与家族成员的互作见图4，在NH3与NH3和NH4的组合中都观察到较强的荧光信号，但与NH5没有观察到信号。

NH4与家族成员的互作见图5，NH4与NH4和NH5的组合中都有很
强的荧光信号。

NH5与NH5自身的相互作用见图6所示，NH5自身可以相互结合，产生YFP荧光信号。

将NH1家族蛋白之间双分子荧光互补试验的结果总结于图7。

下方的图为正常光视野下的细胞，上方的图为同样的细胞在荧光下的信号。

The
lower pictures were cells under light field,the upper ones were same cells under fluorenscence.图3 NH1与NH1家族成员双分子荧光互补试验Fig.3 Biomolecular Fluorescence Complementation assay for NH1 with NH1 family members
图4 NH3与NH1家族成员双分子荧光互补试验Fig.4 Biomolecular Fluorescence Complementation assay for NH3 with NH1 family members
图5 NH4与NH1家族成员双分子荧光互补试验Fig.5 Biomolecular Fluorescence Complementation assay for NH1 with NH4 family members
图6 NH5与NH1家族成员双分子荧光互补试验Fig.6 Biomolecular Fluorescence Complementation assay for NH5 with NH1 family members +.越多表示信号越强；-.表示没有信号。

+.Means stronger signals；-.Means
no signal.图7 NH1家族蛋白的双分子荧光互补试验结果总结Fig.7 Summary of Biomolecular Fluorescence Complementation assay within NH1 family members
3 结论与讨论
通过双分子荧光互补试验可知，在水稻原生质体内，除NH2不与任何家族成员的蛋白互作以外，NH1、NH3、NH4和NH5都会和自身的蛋白互作，产生荧光信号，并且它们还会和家族成员的其他蛋白相互结合产生荧光信号。

目前已经研究清楚，拟南芥中水杨酸介导的系统获得抗性的关键调控因子NPR1，被诱导前在细胞质中是以寡聚体的形式存在的，当细胞内水杨酸含量增加，使得细胞还原势增加时，NPR1被解离成单体，才得以进入细胞核与TGA转录因子结合，作为转录共激活
因子起作用，启动防御基因的表达，使植物产生抗性[22]。

Chern等[23]的试验已证明NH1参与了水稻抗病防御反应，在酵母双杂交试验中NH1可以和水稻中的
转录因子rTGA2.2有很强的相互作用。

至于NH1在细胞内是否也存在类似于
NPR1的行为，目前还不清楚。

通过我们的试验结果可知，NH1自身可以相互结合，这说明NH1在细胞内有可能会形成二聚体或寡聚体。

至于更详细的机制还需要进一步的试验提供更多的证据。

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