亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与2型糖尿病的相关性

亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与2型糖尿病的相关性赵保明;赵莉;贺文欣;王元元;李徽徽;周艳梅
【摘要】目的:探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T和A1298C多态性与2型糖尿病(T2DM)的关系.方法:选取106例T2DM患者(病例组)和109名健康对照个体(对照组),采用聚合酶链反应-限制性片段多态性分别检测C677T和
A1298C多态位点等位基因频率和基因型并统计分析.结果:2组MTHFR基因
C677T和A1298C位点基因型和等位基因频率比较差异均无统计学意义
(P>0.05),T2DM发病中2个突变位点之间没有协同作用(P>0.05).结论:MTHFR基因C677T和A1298C多态位点与T2DM的易感性无明显的相关性.
【期刊名称】《蚌埠医学院学报》
【年(卷),期】2014(039)002
【总页数】3页(P155-157)
【关键词】糖尿病,2型;亚甲基四氢叶酸还原酶;基因多态性
【作者】赵保明;赵莉;贺文欣;王元元;李徽徽;周艳梅
【作者单位】蚌埠医学院组织胚胎学教研室,安徽,蚌埠,233030;蚌埠医学院解剖学教研室,安徽,蚌埠,233030;蚌埠医学院组织胚胎学教研室,安徽,蚌埠,233030;蚌埠医学院组织胚胎学教研室,安徽,蚌埠,233030;蚌埠医学院组织胚胎学教研室,安徽,蚌埠,233030;蚌埠医学院组织胚胎学教研室,安徽,蚌埠,233030
【正文语种】中文
【中图分类】R587.1
糖尿病是目前威胁人类健康的一种常见病，是由多个遗传因素和环境因素所致的慢性进展性疾病。

2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)可能是一种异质性情况，对其易感基因的研究一直是人们所关注的课题。

亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是甲硫氨酸-叶酸代谢中的一个关键酶，该酶活性的改变会导致5-甲基四氢叶酸生成障碍，从而造成同型半胱氨酸复甲基化障碍，引起高半胱氨酸血症、高半胱氨酸尿症和血浆低甲硫氨酸;同时也会影响DNA 合成和甲基化，进而影响许多疾病的遗传易感性。

近年来，MTHFR 基因因遗传多态性跟多种疾病相关而备受关注。

研究［1］表明，MTHFR 基因多态性分布在不同地区、不同人种之间有差异。

本实验运用聚合酶链反应-限制性片段多态性技术检测T2DM 患者MTHFR 基因C677T 和A1298C 多态性，并以健康人群作为对照，旨在探讨皖北地区汉族人群MTHFR基因C677T 和
A1298C 多态性与T2DM 的关系。

1 资料与方法
1.1 研究对象收集T2DM 患者106 例(1999年WTO 诊断标准)为病例组，取自蚌埠医学院第一附属医院内分泌科，其中男68 例，女38 例;年龄46 ～72 岁。

均系门诊及住院未经治疗的初诊T2DM 患者，无糖尿病并发症、高血压及冠心病。

109 名健康对照者(对照组)来自蚌埠医学院第一附属医院同期健康体检者，根据年龄和性别与病例组进行频数配对。

所有样本之间无血缘关系。

1.2 实验方法
1.2.1 样本采集抽取所有研究对象的清晨空腹静脉血2 ml，血液均由乙二胺四乙酸二钠抗凝，标本收集后立即放入-80 ℃冰箱冷冻保存。

DNA 纯化试剂盒(TaKaRa 公司)抽提基因组DNA。

1.2.2 MTHFR 基因目的片段扩增 MTHFR 基因引物C677T F:5'-TGA AGG AGA
AGG TGT CTG CGG GA-3'，R:5'-GGA CGG TGC GGT GAG AGT C-3'，
A1298C F:5'-CTT TGG GGA GCT GAA GGA CTA CTA C-3'，R:5'-CAC TTT GTG ACC ATT CCG GTT TG-3'(由大连宝生物公司合成)。

反应体系:总反应体系
25 μl，上、下游引物各2 μl，模板DNA 2 μl，Water nuclease-free 6.5 μl。

反
应条件:94 ℃预变性5 min，94 ℃变性60 s，退火温度59 ℃(C677T)或
51 ℃(A1298T)1 min，72 ℃延伸30 s，共35 个循环，最后72 ℃延伸8 min。

1.2.3 限制性核酸内切酶酶切反应限制性内切酶HinfⅠ和MboⅡ各1.2 μl 分别酶切消化C677T和A1298C 的PCR 扩增产物(各17 μl)总体积均为25 μl，轻轻混
匀后置37 ℃水浴酶切7 h，然后放入65 ℃温箱中20 min，终止酶切反应。

1.3 统计学方法采用Hardy-Weinberg 遗传平衡检验及χ2 检验。

2 结果
2.1 酶切结果经Hardy-Weinberg 遗传平衡定律检验各基因型频率已达遗传平衡，具有群体代表性。

MTHFR 基因C677T 酶切后，只有198 bp 片段为CC纯合子，有175 bp 和23 bp 2 个片段为TT 纯合子，有198 bp、175 bp 和23 bp 3 个
条带为CT 杂合子(见图1);A1298C 酶切后AA 基因型产生片段为56 bp、31 bp、30 bp、28 bp、18 bp，CC 基因型包含的片段有84 bp、31 bp、30 bp、18 bp，而AC 杂合子的片段有84 bp、56 bp、31 bp、30 bp、28 bp、18 bp(见
图2)。

2.2 2组基因型和等位基因频率比较以比值比(OR)及其95%可信区间(95% CI)表
示MTHFR C677T 和A1298C 各基因型及等位基因与T2DM 之间的相关性，2组各基因型和等位基因分布比较差异均无统计学意义(P ＞0.05)(见表1)，MTHFR 基因C677T 和A1298C 多态位点与T2DM 的发病无相关性。

2.3 MTHFR 基因C677T 和A1298C 两个突变位点在同一T2DM 患者发病过程中
与对照组中的遗传多态性比较 2组2 个突变位点之间比较差异均无统计学意义(P ＞0.05)(见表2)，说明2 个突变位点之间在T2DM 发病过程中没有协同作用。

表1 2组基因型和等位基因频率比较［n;百分率(%)］A1298C AA AC CC A-allete T-allete病例组 106 47(44.34) 41(38.68) 18(16.98) 135(63.68) 77(36.32) 53(50.00) 39(36.79) 14(13.21) 145(68.40) 67(31.60)对照组 109 58(53.21)
38(34.86) 13(11.93) 154(70.64) 64(29.36) 51(46.79) 46(42.20) 12(11.01)
148(67.89) 70(32.11)OR(95%CI) — 1.00 1.33(0.74 ～2.39) 1.39(0.64 ～3.02) 1.00 1.37(0.92 ～2.06) 1.00 0.82(0.46 ～1.45)1.12(0.47 ～2.66) 1.00
0.98(0.65 ～1.47)P ——＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05分组 n
C677T CC CT TT C-allete T-allete
表2 2组MTHFR 基因2 个突变位点各基因型相互作用比较［n;百分率(%)］TT AA AC CC病例组 34(32.08) 18(16.98) 4(3.77) 28(26.42) 8(7.55) 1(0.94)
11(10.38) 2(1.89) 0(0.00)对照组 27(24.77) 23(21.10) 7(6.42) 30(27.52)
12(11.01) 2(1.83) 7(6.42) 1(0.92) 0(0.00)OR(95%CI) 1.00 0.62(0.28 ～1.38)
0.45(0.12 ～1.71) 0.74(0.36 ～1.52) 0.53(0.19 ～1.48) 0.40(0.03 ～4.62)
1.25(0.43 ～3.65)1.59(0.13 ～18.46)P—＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05分组CC AA AC CC CT AA AC CC
3 讨论
编码MTHFR 的基因定位于1 号染色体短臂上(1p36.3)，其最常见的突变基因位
点为C677T，其次是A1298C。

现已证明MTHFR 基因突变与多种疾病相关，其
中MTHFR 基因突变与糖尿病及其并发症的相关性研究是近年来研究的一个热点。

我们首次对皖北地区MTHFR 基因C677T 和A1298C 位点的遗传多态性与2 型糖尿病患病的相关性作了初步研究。

我们发现，MTHFR 基因C677T 位点T 等位基因突变频率病例组为36.32%，与
对照组(29.36%)比较差异无统计学意义(P ＞0.05);2组之间的各基因型频率比较差异均无统计学意义(P ＞0.05)，表明MTHFR 基因C677T 多态位点与皖北地区
T2DM的发病无相关性。

本结果同其他国家和地区［2-6］结果一致。

但也有国外学者［7-8］报道MTHFR 基因C677T 突变位点与T2DM 发病相关。

我们发现皖北地区677TT 基因型频率在病例组和对照组都最低(分别为16.98%和11.93%)，病例组与摩洛哥［8］(8.87%)以及中国台湾［5］(53.9%)等地域患者频率有差异;对照组与摩洛哥［8］(9.92%)和中国台湾［5］(58.1%)也有差异，但与吴华彰等［9］报道结果一致。

说明MTHFR 基因C677T 位点遗传多态性在不同地域或人种中具有明显差异。

另外，我们同时探讨了MTHFR 基因A1298C 多态性与T2DM 发病的相关性，结果显示，病例组A1298C 各基因型频率及其等位基因频率与对照组比较差异均无统计学意义(P ＞0.05)，说明MTHFR基因A1298C 位点突变与皖北地区T2DM 发病也不具有相关性。

有关MTHFR 基因A1298C 位点多态性与T2DM 关系的报道较少。

波兰学者Moczulski等［10］报道A1298C 位点多态性与不同阶段糖尿病肾病发病不相关，但与神经管发育缺陷和心血管疾病发病相关。

提示A1298C 位点多态性与其他地区的其他疾病具有相关性。

最后，为了进一步探讨MTHFR 基因C677T 和A1298C 突变位点在T2DM 发病过程中是否具有协同作用，我们对2 个突变位点的基因型联合分析，结果显示，2 个位点的各种基因型在T2DM 发病过程中不具有协同作用(P ＞0.05)。

但摩洛哥学者［8］和波兰学者［10］研究发现双杂合子677CT 和1298AC在T2DM 发病过程中具有高风险性(P ＜0.05)。

也有报道［11］显示，MTHFR 基因C677T 多态性跟T2DM 的相关性比A1298C 密切，这种差异可能是由于C677T 突变降低酶活性的作用比A1298C 突变位点大(分别降低70%和30%)造成的。

总之，我们通过实验证实MTHFR 基因C677T和A1298C 多态位点与皖北地区
T2DM 的发病无相关性，两者也不具有协同作用。

至于MTHFR 基因其他位点多态性是否和皖北地区T2DM 发病具有相关性，或者MTHFR 基因C677T 和
A1298C 是否与皖北地区T2DM 并发症具有相关性有待进一步研究证实。

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