5-杂氮-2′脱氧胞苷对肝癌细胞中TIMP-3基因的作用

5-杂氮-2′脱氧胞苷对肝癌细胞中TIMP-3基因的作用
曾伟;沈波;聂玉强;李爱民;陈阮然
【摘要】目的：观察多株肝癌细胞中TIMP-3 CpG岛的甲基化状况，观察甲基化药物5-杂氮-2′脱氧胞苷对肝癌细胞株中TIMP-3基因表达及其CpG岛甲基化程
度的影响。

方法运用MSP定性检测8株肝癌细胞中TIMP-3 CpG岛甲基化状况。

使用去甲基化药物5-杂氮-2′脱氧胞苷对甲基化阳性的细胞株进行干预，观察干预组与对照组TIMP-3基因表达差异，并使用焦磷酸测序技术定量检测CpG岛甲基化差异。

结果在8株肝癌细胞系中C3A、Hep-3B、HepG23株检测到TIMP-3 CpG岛甲基化阳性。

经去甲基化药物干预后，在这3株肝癌细胞中均发现TIMP-
3 mRNA的表达较对照组有明显上调（P<0.05）， CpG岛的甲基化率下降
（P<0.05）。

结论甲基转移酶抑制剂能显著降低肝癌细胞株TIMP-3 CpG岛甲基化程度及上调TIMP-3 mRNA的表达。

%Objective The aim of this study is to investigate the CpG island methylation status of TIMP-3 in HCC cell lines,
to treate the HCC cells that exhibit positive methylation with DNA methyltransferase in-hibitor (5-Aza-CdR ), and to observe the influence of
5-Aza-CdR on the expression of TIMP-3 mRNA and its CpG island methylation degree. Methods TIMP-3 CpG methylation status of HCC cells were examined using MSP assay. Methylation-positive HCC cells were treated with DNA methyltransferase inhibitor (5-Aza-CdR) (intervention group), and the difference of TIMP-3 mRNA expression was observed between interven-tion group and control group. Pyrosequencing method was applied to quantitatively examine the CpG island methylation percentage. Results The methylation of TIMP-3 CpG islands in C3A, HepG-
2, and Hep-3B was positive. The results showed that TIMP-3 mRNA expression was increased (P<0.05) and the methylation level was decreased (P<0.05) in the intervention group compared to control group. Conclusion 5-Aza-CdR could remarkably reduce the level of the CpG island methylation and increase the expression of TIMP-3 mR-NA in HCC cells.【期刊名称】《现代消化及介入诊疗》
【年(卷),期】2013(000)006
【总页数】4页(P340-343)
【关键词】肝癌;TIMP-3;甲基化;5-杂氮-2′脱氧胞苷
【作者】曾伟;沈波;聂玉强;李爱民;陈阮然
【作者单位】510180广州医科大学附属广州市第一人民医院消化内科，广州市消化病重点实验室;510180广州医科大学附属广州市第一人民医院消化内科，广州
市消化病重点实验室;510180广州医科大学附属广州市第一人民医院消化内科，
广州市消化病重点实验室;510180广州医科大学附属广州市第一人民医院消化内科，广州市消化病重点实验室;510180广州医科大学附属广州市第一人民医院消
化内科，广州市消化病重点实验室
【正文语种】中文
DNA的甲基化属于表观遗传学范畴，它对基因表达的调控不依赖于基因序列改变，DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase,DNMTs）将甲基集团催化，转移到5′-CpG-3′中胞嘧啶的第五位碳原子上，从而生成甲基化DNA。

人类中DNA甲基化大多发生于CpG二核苷酸的胞嘧啶上。

DNA甲基化通常通过抑制转录因子与
启动子结合[1]，改变染色质结构，促进转录抑制子的结合等方式使基因表达沉默[2]。

在肿瘤组织中，与基因序列的改变导致的遗传信息改变不同，表观遗传改变不具有遗传改变的永久，这种改变潜在是可逆的[3]。

因此，对相关抑癌基因甲基化状态的干预有望成为恶性肿瘤新的治疗靶点[4]。

5-杂氮-2′脱氧胞苷（5-AZa-CdR）是一种竞争性核苷酸类甲基转移酶抑制剂，与DNA甲基转移酶共价
结合，使DNA甲基转移酶的生物活性降低，继而上调基因的表达。

在本研究中，我们挑选经MSP检测TIMP-3 CpG岛甲基化阳性的细胞株进行5-AZa-CdR药物干预，并与对照组对比，观察药物干预组与对照组在基因表达上的变化及并定量检测甲基化率的变化。

一、材料
1.肝癌细胞株
C3A，Hep-3B，QSG-7701，HepG2，SMMC-7721，Huh-7，PLC/PRF/5，BEL-7402均购自中山大学细胞库。

2.主要试剂
所有细胞培养试剂均购自GIBICO公司，5-杂氮-2′脱氧胞苷购自Sigma公司，DNA提取试剂盒NucleoSpinRTissue购自MACHEREY-NAGEL公司，QIAGEN EpiTect Bisulfie kit、QIAGEN Pyro－Mark PCR kit及焦磷酸测序相关试剂均购自QIAGEN公司，ZymoTaqTM PreMix购自Zymo公司，Trizol购自Invitrogen公司，PrimeScriptRRT reagent Kitwith gDNA Eraser购自大连宝生物公司，SYBR Green qPCR Master Mixes购自Thermo公司。

3.主要设备
Forma 371 CO2培养箱（Thermo公司，美国），Bio-Rad梯度PCR仪（Bio-Tek公司，美国），MJR Option，荧光定量PCR仪（MJ Research，美国），PyroMark Q96 ID（QIAGEN公司，德国），Bio-Rad电泳仪（美国Bio-Tek公
司），GENEGENIUS GEL DOC 2000凝胶成像系统（SYNGENE公司，英国）。

二、方法
1.细胞培养及处理
C3A，QSG-7701，SMMC-7721，BEL-7402使用RPMI-1640完全培养液培养，Hep-3B，HepG2使用DMEM完全培养液培养。

完全培养液中含10%小牛血清
和终浓度分别为100 U/mL的青霉素和100μg/mL链霉素。

以上细胞均置于37℃，5%CO2培养箱中培养，每3～4天传代1次，两次传代间期换液1次。

2.甲基化特异性PCR（MSP）
提取8株肝癌细胞的基因组DNA，并取1μg DNA使用EpiTect Bisulfie kit （QIAGEN,Germany）进行亚硫酸盐转化，各得到40μL亚硫酸盐转化后DNA。

由Methprimer在线设计甲基化及非甲基化特异性识别引物，引物由Invitrogen
公司合成。

甲基化特异性识别引物为5′-TCGAGGATTTAGCGGTAAGTATC-3′和5′-GAAAACAAAAAATAACGAAACGAA-3′，非甲基化特异性识别引物为5′-TTGAGGATTTAGTGGTAAGTATTGG-3′和5′-CAAAAACAAAAAATAACAAAACAAA-3′，产物分别为131 bp和132 bp。

PCR 反应体系为25μL，含2×ZymoTaqTM PreMix 12.5μL，上游引物及下游引物
（浓度为10μM）各1μL，双蒸水8.5μL，模板2μL。

反应条件为：95℃预变性
10 min。

94℃变性30 s；54℃退火30 s；72℃延伸30 s，循环40次。

最后72℃延伸7 min。

取10μL扩增产物于含EB终浓度为0.5μg/mL的2%琼脂凝胶电泳
30 min后凝胶成像系统观察拍照。

并判断MSP结果：若样本MSP后出现甲基化条带，判断为甲基化阳性；若仅出现非甲基化条带，判断为甲基化阴性。

取MSP
甲基化特异性和非甲基化特异性PCR产物进行TA克隆，并测序，该部分操作交
由Invitrogen公司完成。

将测序所得序列和目的序列比对，明确MSP产物的特
异性。

3.甲基转移酶抑制剂对肝癌细胞的干预
选取MSP检测甲基化阳性的细胞株，常规细胞传代，待6～8 h细胞贴壁后，弃
去培养液。

干预组加入含5-杂氮-2′脱氧胞苷（5-Aza-CdR）终浓度为5 μmol/L
的培养液，对照组使用不含药物培养液。

每24 h换液1次，待药物作用48 h后
收集细胞。

每株细胞干预组与对照组均行3次重复实验。

4.荧光定量PCR检测5-Aza-CdR对肝癌细胞中TIMP-3表达的影响
提取细胞总RNA并逆转录。

TIMP-3引物[5]为5′-CTACACCATCAAGCAGATGAAGATG-3′和5′-GCTCAGGGGTCTGTGGCATTGAT-3′产物457 bp，内参GAPDH引物序列为5′-GACCTGACCTGCCGTCTA-3′和5′-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3′产物为131 bp。

荧光定量PCR在MJR Option荧光定量PCR仪上进行，反应体系运用SYBR Green qPCR Master Mixes（Thermo，USA）。

反应条件为：95℃15 min，95℃15 s，56℃30 s，72℃30 s，循环40次。

参考文献[6]，以2-ΔΔCT
计算干预组目的基因相对于对照组目的基因的表达倍数[ΔΔCT=（干预组内参基因CT值-对照组内参基因CT）-（干预组目的基因CT值-对照组目的基因CT）]。

5.焦磷酸测序检测5-Aza-CdR对肝癌细胞中
TIMP-3 CpG岛甲基化程度的影响
提取干预组及对照组细胞DNA并进行亚硫酸转化。

参考文献[7]，选取焦磷酸测
序检测位点，由PyroMark Assay Design Software 2.0设计测序焦磷酸测序模板扩增引物（F、R）和焦磷酸测序引物（S），引物序列：F 5′-TAGGTGGGAGTGGGGTTAGG-3′，R Biotin-5′-AACCCCCCCCCTCAAACCAATAAC-3′，S 5′-GTTTTTTTTTTGGAG-3′。

根据PyroMark PCR kit的说明，取亚硫酸氢盐修饰后的DNA 2μL进行测序模板扩增。

使用PyroMark Q96 ID测序仪，按测序操作说明书对测序模板处理并进行焦磷酸
测序。

系统自动给出检测位点的甲基化率，参照文献[7-8]，计算每个样品各个检
测位点的平均值代表该样品的甲基化率。

三、数据统计
所有实验数据应用SPSS17.0统计分析软件包处理。

计量资料以x±s表示，两组
数据间的差异采用独立样本的T检验。

以P＜0.05作为差异间具有统计学意义。

一、肝癌细胞中TIMP-3 CpG岛的甲基化状况定性检测结果
将MSP产物测序结果与TIMP-3甲基化特异性产物及非甲基化特异性产物序列进行比对，结果发现可完全匹配，说明所用引物的特异性好。

在八株肝癌细胞系中，C3A、HepG-2、Hep-3B出现了甲基化和非甲基化条带，判定这三株细胞TIMP-3 CpG岛甲基化阳性，其余五株细胞均只出现非甲基化条带，判断为甲基化阴性，见图1。

二、甲基转移酶抑制剂对TIMP-3 mRNA表达的影响
在TIMP-3 CpG岛甲基化阳性的C3A、HepG2、Hep-3B三株细胞中，5-Aza-CdR均可成功诱导基因表达上调，与对照组差异显著，具有统计学意义。

其中
C3A细胞组2-ΔΔCT=2.78±0.36，P= 0.001；Hep-3B细胞组2-
ΔΔCT=5.38±1.57，P=0.04；HepG-2细胞组2-ΔΔCT=3.66±0.55，P=0.001。

如图2。

三、5-Aza-CdR对TIMP-3 CpG岛的去甲基化作用
焦磷酸测序结果显示，在C3A、HepG2、Hep-3B三株细胞中，干预组的甲基化
频率较对照组均呈现一定程度的下降（见表1），差异具有统计学意义，其中
C3A组P=0.012，Hep-3B组P=0.00，HepG2组P=0.000，见表1，图3。

原发性肝癌在我国是继肺癌之后引起高死亡率的第二大恶性肿瘤[9]。

长期以来包
括手术切除、局部消融、放化疗及其他综合治疗并没有给肝癌患者带来满意的生存率[10]，所以迫切需要寻找新的有效的治疗方法及治疗靶点。

基质金属蛋白酶组织
抑制因子3（metalloproteinase inhibitor 3,TIMP-3）位于人染色体22q12，是一种分子量为24 KD的分泌型蛋白[11]。

楔形的TIMP3蛋白通过插入MMPs分子的裂隙状活性部位而与MMPs形成1:1的复合物，从而抑制MMPs活性，保护细胞外基质（extracelluar matrix,ECM）不被基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）降解和重塑[12-13]。

近年来研究
表明TIMP-3基因启动子CpG岛异常甲基化与其蛋白的表达缺失密切相关，而这种甲基化作用在正常组织中比较少见，提示肿瘤中TIMP-3基因的甲基化是抑制TIMP-3蛋白表达的主要原因之一[14]。

本实验我们用MSP方法定性检测了8株肝癌细胞中TIMP-3 CpG岛甲基化状况，发现其中C3A、HepG-2、Hep-3B为甲基化阳性。

而当我们使用去甲基化药物5-Aza-CdR对这三株细胞进行干预后，这3株的中TIMP-3 mRNA表达均较各自对照组有不同程度的上调，且CpG岛甲基化程度下降。

这提示TIMP-3 CpG岛的甲基化可能是其在肝癌中的低表达原因之一，这也为使用去甲基化药物对肝癌进行个性化治疗提供了初步的实验基础。

在本实验中我们使用了MSP定性及焦磷酸测序定量的方法分析TIMP-3 CpG岛的甲基化。

在实验过程中我们比较了两种方法各自的优缺点。

MSP是一种灵敏度高的甲基化检测方法，可检出比例为千分之一的甲基化等位片段。

它对细胞株的检测结果较为稳定，而在比较癌及癌旁组织的甲基化状况时，可能由于取材时癌旁组织受癌组织的污染而出现假阳性。

甲基化的焦磷酸测序就是通过4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，通过检测亚硫酸转化后样本中甲基化位点上C/T的比例来定量该位点甲基化的程度。

具有高通量，重复性和精确性好的优点。

然而在实验过程中我们也发现这种方法的一些不足之处：①测序片段不能过长，一般限制在60 bp以内，建议40 bp以内可以得到比较理想的结果，这也就限制了CpG检测个数；②重复序列容易使测序失败，然而经过亚硫酸转化后出现Poly T 结构的可能性增加，在选择测序位点时应注意避开；③并不适合用来做甲基化的定
性判断。

有研究者认为考虑背景荧光的干扰，将甲基化率12%做为划分甲基化阳性和阴性的界限[15]，也有研究者定义为5%[16]或15%[8]。

而我们在实验过程中发现，测序体系中测序模板丰度越高，检测出来的信号峰值越高，背景信号的影响越小。

然而，测序体系中测序模板丰度受PCR反应，产物处理过程中丢失等因素的影响。

故每个测序体系中背景荧光对实验结果的干扰并不一致。

因此，以单一阈值来区分甲基化阳性和阴性可能带来假阴性结果。

并且根据我们的研究结果及其他研究者的研究结果[17]表明，一段序列中各个位点的甲基化程度并不一致。

若划定一条统一的阈值线，这就可能出现研究同一基因的因检测不同位点而得出相反的结论，这显然不合理。

所以，我们认为对焦磷酸结果简单设置单一阈值来判定甲基化阳性和阴性并不合理。

【相关文献】
1 Attwood JT,Yung RL,Richardson BC.DNA methylation and the regulation of gene transcriPtion.Cell Mbl Life Sci,2002,59(2):241-257.
2 Nan X,Ng HH,Johnson CA,etal.Transcriptionalrepression by the methyl-CpG-binding protein MeCP2 involves a histone deacetylase complex.Nature,1998,393(6683):386-389.
3 Galm O,Herman JG,Baylin SB.The fundamental role of epigenetics in hematopoietic malignnancies.Blood Rev,2006,20(1):1-13.
4 Sawada M,Kanai Y,Arai E.Increased expression of DNA methyltransferase
1(DNMT1)protein in uterine cervix squamous cell carcinoma and its precursor
lesion.Cancer Lett,2007,251(2):211-219.
5 Gu P,Xing X,Tänzer M,etal.Frequentloss of TIMP-3 expression in progression ofesophagealand gastric adenocarcinomas.Neoplasia,2008,10(6):563-572.
6 Schmittgen TD,Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative
C(T)method.Nat Protoc,2008,3(6):1101-1108.
7 Ju HX,An B,Okamoto Y,Shinjo K,etal.Distinctprofiles ofepigenetic evolution between colorectal cancers with and withoutmetastasis.Am JPathol,2011,178(4):1835-1846.
8 Hama R,Watanabe Y,Shinada K,et al.Characterization of DNA hypermethylation in two cases of peritonealmesothelioma.Tumour Biol,2012,33(6):2031-2040.
9陈建国,张思维,陈万青.中国2004-2005年全国死因回顾抽样调查肝癌死亡率分析.中华预防医学
杂志,2010,44(5):383-389.
10 Mann CD,Neal CP,Garcea G.Prognostic molecular markers in hepatocellularcarcinoma:a systematic review.Eur JCancer,2007,43 (6):979-992.
11 LambertE,Dasse E,Haye B,et al.TIMPs as multifaeial Proteins. CritRev OneolHematol,2004,49(3):187-198.
12 Cruz-Munoz W,Khokha R.The role of tissue inhibitors of metalloproteinases in tumorigenesis and metastasis.Crit Rev Clin Lab Sci, 2008,45(3):291-338.
13 Woessner JF Jr.That impish TIMP:the tissue inhibitor of metalloproteinases-3.J Clin Invest,2001,108(6):799-800.
14 Bachman K,Herman J,Corn P,et al.Methylation-associated silencing of the tissue inhibitor of metalloproteinase-3 gene suggesta suppressor role in kidney,brain,and other human cancers.Cancer Res,1999,59(4):798-802.
15 Gao W,Kondo Y,Shen L,etal.Variable DNA methylation patterns associated with progression of disease in hepatocellular carcinomas. Carcinogenesis,2008,29(10):1901-1910.
16李慎.基因启动子甲基化与肺癌的相关性研究[D].重庆:第四军医大学,2010.
17杜传清,毛平,王艳茹,等.急性髓系白血病BCL2L10基因启动子区异常甲基化定量研究.实用医学,2012,28(20):3397-3340.。