归脾汤对慢性睡眠剥夺大鼠HPA轴功能及单胺类神经递质的影响

·实验研究·
福建中医药2022年2月第53卷第2期
Fujian Journal of TCM February 2022，53（2）
归脾汤对慢性睡眠剥夺大鼠HPA 轴功能及单胺类神经递质的影响
张敏1，2，3，黄俊山1，2，3，张一帆1，2，3，曾雪爱1，2，王秀峰1，2，3，陈铭奇1，2，3，张娅1，
2，3
（1.福建省中医药科学院，
福建福州350003；2.福建省中医睡眠医学重点实验室，福建福州350003；3.黄俊山福建省名老中医药专家传承工作室，福建福州350003）
摘要：目的观察归脾汤（GPD ）对慢性睡眠剥夺大鼠HPA 轴功能及单胺类神经递质的影响。

方法
将48只SD 雄性大鼠根据体质量按分层随机分组方法分为正常对照组8只和造模组40只，造模组应用改良水平台法进行慢性睡眠剥夺，造模周期21d 。

造模成功后将造模组大鼠随机分为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、艾司唑仑组，每组8只。

于第15天开始，各组大鼠均按体质量1mL/100g 灌胃给药，低、中、高剂量组分别灌胃0.47、0.93、1.86g/mL GPD 药液，艾司唑仑组灌胃0.009mg/mL 艾司唑仑溶液，正常对照组和模型组灌胃等体积生理盐水。

每日1次，连续灌胃7d 。

于第21天观察大鼠一般状态；末次给药30min 后检测大鼠睡眠潜伏期和睡眠持续时间；酶联免疫吸附（ELISA ）法检测大鼠血清和下丘脑中促肾上腺皮质激素释放激素（CRH ）、促肾上腺皮质激素（ACTH ）和皮质醇（CORT ）含量；高效液相色谱（HPLC ）法检测大鼠前额叶5-羟色胺（5-HT ）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA ）、去甲肾上腺素（NE ）和多巴胺（DA ）含量。

结果与正常对照组比较，模型组大鼠昼夜节律紊乱，精神倦怠，饮食减少，反应迟钝，血清和下丘脑中CRH 、ACTH 和CORT 含量明显升高（P 均＜0.01），5-HT 、5-HIAA 含量降低（P 均＜0.01），NE 和DA 含量升高（P ＜0.05或0.01）；与模型组比较，GPD 各剂量组和艾司唑仑组大鼠昼夜节律紊乱和精神状况得到改善，毛发相对润泽，反应相对灵敏，CRH 、ACTH 和CORT 含量均明显降低（P 均＜0.01），5-HT 、5-HIAA 含量升高（P ＜0.05或0.01），NE 和DA 含量降低（P ＜0.05或0.01），且以GPD 中剂量组各指标最接近正常对照组。

结论GPD 具有较好改善慢性睡眠剥夺大鼠睡眠的作用，其机制可能与降低血清和下丘脑CRH 、ACTH 和CORT 含量，升高5-HT 、5-HIAA 含量，降低NE 和DA 含量有关。

关键词：归脾汤；慢性睡眠剥夺；下丘脑-垂体-肾上腺轴；单胺类神经递质中图分类号：R285.5
文献标志码：Ａ
文章编号：1000-338X （2022）02-0015-03
慢性失眠发生与下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA ）及脑内多种神经递质密切相关，病情大多反复难愈，根治困难。

归脾汤（Gui Pi Decotion ，GPD ）是临床治疗心脾两虚型失眠的经典方，广泛应用于临床，但其治疗慢性失眠的机制尚不明确。

HPA 轴是最原始的内源性昼夜节律调节系统，其中促肾上腺皮质激素释放激素（CRH ）、促肾上腺皮质激素（ACTH ）和皮质醇（CORT ）是HPA 轴重要的组成激素，与睡
眠密切相关［1］。

HPA 轴能调控脑内多种神经递质，其失常可导致单胺类递质如5-羟色胺（5-HT ）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA ）、甲肾上腺素（NE ）和多巴胺（DA ）等的改变。

因此，本实验通过改良水平台法建立大鼠慢性睡眠剥夺模型，探讨GPD 对CRH 、ACTH 和CORT 以及5-HT 、5-HIAA 、NE 、DA 含量的影响。

1材料
1.1实验动物SPF 级SD 雄性大鼠48只，8~9周龄，体质量（200±20）g ，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号为SCXK （沪）2018-0006，在福建省中医药科学院比较医学实验中心饲养1周。

饲养环境安静，恒温（22±1）℃，每日12h 固定照明（8：00开灯），并可自由摄取食物和水，合格证号为SYXK （闽）2016-0005。

本实验获得福建省中医药科学院动物伦理委员会批准（审批号：FJATCM-IAEC2020010）。

1.2药物与主要试剂人参、木香、远志、当归、白术、茯神、黄芪、龙眼肉、炒酸枣仁、炙甘草（福建省鹭燕医药有限公司，批号：190601、1907028077、190901、190515、1905018082、190901、190522、190808、190620、190820-010）；艾司唑仑（济川药业集团有限公司，批号：20200501）；CRH 、ACTH 、CORT 酶联免疫吸附（ELISA ）试剂盒（美国Trust Specialty Zeal 公司，型号：RG-28912、R6404、RG18882）；水合氯醛（北京雷根生物技术有限公司，货号：R00635）；5-HT 、5-HIAA 、NE 、DA 试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，批号：B21833、B27047、B24713、B25300）。

1.3主要仪器Rayto RT-6100酶标分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；Rigol L3000高效液相色谱仪（普源精电科技股份有限公司）；Kromasil C18反相色谱柱（荷兰Nouryon 公司）。

2方法
2.1实验方法
2.1.1GPD 药液的制备称取人参10g ，木香10g ，远志10g ，当归10g ，白术20g ，茯神20g ，黄芪20g ，龙眼肉20g ，炒酸枣仁20g ，炙甘草5g 。

先量取10倍
收稿日期：2021-09-22基金项目：福建省属公益类科研院所基本科研专项（2019R1003-3）；
福建省自然科学基金面上项目（2019J01721）；国家科技部重点研发计划项目（2018YFC1705600）
作者简介：张敏（1986—），女，医学硕士，助理研究员，主要从事中
西医结合睡眠障碍的基础与临床研究。

15
福建中医药第53卷
总量冷水浸泡30min，武火煮沸后文火继续煮20min，过滤，收集滤液；次煎再加冷水没过中药，武火煮沸后文火继续煮30min，过滤。

将两份滤液合并，浓缩至1.86g/mL GPD药液。

将药液与蒸馏水分别按1∶1及1∶3稀释，可得0.93g、0.47g/mL GPD药液。

2.1.2大鼠慢性睡眠剥夺模型制备将48只大鼠随机分为正常对照组8只及造模组40只，造模组大鼠均通过改良水平台法进行慢性睡眠剥夺。

参考文献［2］，造模组大鼠每天（16：00—次日10：00）睡眠剥夺18h，次日（10：00—16：00）放回笼内休息6h，实验周期为21d。

正常对照组采用大平台实验环境，不进行任何处理，标准化饲养。

若大鼠出现白天活动增加，夜间慵懒喜卧，昼夜节律紊乱，喜静少动，饮食减少，体质量降低，反应迟钝，时有焦虑易激惹现象，较正常对照组明显不同，提示模型制备成功［2］。

2.1.3分组与给药除正常对照组外，将造模成功的大鼠按分层随机分组方法分为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组及艾司唑仑组，每组8只。

造模第15天，低、中、高剂量组分别以0.47、0.93、1.86g/mL GPD（相当于临床人日用量的3、6、12倍），艾司唑仑组以0.009mg/mL艾司唑仑（相当于人临床日用量的6倍），正常对照组及模型组以生理盐水，均按1mL/100g体质量灌胃。

每天1次，连续7d。

2.1.4组织标本的采集造模后21d给药后开始禁食、禁水，24h之后用戊巴比妥钠（1mL/100g）麻醉大鼠，腹主动脉采血；后断头，剪开头皮，用血管钳揭去颅骨和硬脑膜，剪断双侧视神经后用眼科镊子迅速取出大鼠的整个脑组织；冰上剥离全脑，分离下丘脑和前额叶组织，用0.9%氯化钠溶液冲洗干净，放入事先进行标号处理的锡纸包裹好，存入液氮中，转存于-80℃冰箱待测。

2.2观察指标
2.2.1大鼠一般状态观察大鼠的精神活动状态、皮毛颜色是否有光泽、进食饮水量、对外界刺激的反应及体质量变化等。

2.2.2血清和下丘脑中CRH、ACTH、CORT含量测定将下丘脑用PBS制成10%的组织浆液，低温离心15min，吸取上清液；血清低温离心15min，吸取上清液，严格按试剂说明书，采用ELISA测定血清和下丘脑组织中CRH、ACTH、CORT含量。

2.2.3前额叶5-HT、5HIAA、DA、NE含量测定称取约0.1g大鼠前额叶样本，加入0.01mol/L HCLO4溶液进行前处理，冰浴匀浆，冰水浴超声30min。

8000g离心10min，取上清液，针头式过滤器过滤后，制备成供试品溶液待测。

精确称取5-HT、5HIAA、DA、NE，分别用水溶解，定容成10mL配成标准品溶液后待测。

色谱条件：Kromasil C18反相色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相的配制：20mmol/L磷酸二氢钾的水溶液，流速0.8mL/min，柱温30℃，荧光激发波长为285nm，发射波长为318nm。

用流动相过柱子，待基线稳定后开始加样。

分别精密量取5-HT、5HIAA、DA、NE标准品溶液、供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪测定，即得。

2.2.4统计学方法实验数据采用SPSS26.0软件分析。

计量资料符合正态分布的以（xˉ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验；不符合正态分布的以中位数和四分位数来表示，采用非参数检验。

3结果
3.1各组大鼠一般状态正常对照组大鼠精神状态佳，活动灵敏，毛发光泽干净，饮食正常，白天慵懒喜卧，夜间兴奋好动。

模型组大鼠昼夜节律紊乱，精神倦怠，皮肤色泽暗淡，毛发枯燥，喜静少动，饮食减少，体质量降低，时有焦虑易激惹现象。

经治疗后，GPD各剂量组和艾司唑仑组大鼠一般状态均有不同程度的改善。

3.2各组大鼠血清和下丘脑中CRH、ACTH、CORT 含量比较血清中上述指标以中、低剂量组降低最为显著，最接近正常对照组，下丘脑中上述指标以中剂量组降低最为显著，最接近正常对照组。

据此推测慢性睡眠剥夺大鼠会引起HPA轴功能亢进，见表1～表2。

3.3各组大鼠前额叶5-HT、5-HIAA、NE、DA含量比较5-HT和5-HIAA升高以中剂量组效果最佳，最接近正常对照组，NE和DA降低分别以高剂量组和中剂量组效果最佳，最接近正常对照组，见表3。

表1各组大鼠血清中CRH、ACTH、
CORT含量比较（xˉ±s）pg/mL 组别
正常对照组
模型组
艾司唑仑组
高剂量组
中剂量组
低剂量组
n
8
8
8
8
8
8
CRH
9.53±0.74
15.26±1.651）
11.73±1.243）
11.44±1.223）
9.92±1.363）
11.27±1.113）
ACTH
18.01±0.25
24.81±1.651）
22.74±1.993）
21.28±1.213）
21.07±1.533）
19.46±0.853）
CORT
2.46±0.17
3.54±0.341）
3.22±0.202）
3.12±0.423）
2.45±0.213）
2.62±0.223）注：与正常对照组比较，1）P＜0.01；
与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

表2各组大鼠下丘脑中CRH、ACTH、
CORT含量比较（xˉ±s）pg/mL 组别
正常对照组
模型组
艾司唑仑组
高剂量组
中剂量组
低剂量组
n
8
8
8
8
8
8
CRH
6.28±1.18
12.38±1.591）
10.48±1.902）
10.05±1.492）
8.59±1.702）
9.13±1.392）
ACTH
14.95±1.02
20.76±1.071）
20.59±1.26
20.49±1.74
18.03±1.552）
17.18±1.432）
CORT
17.5±1.77
31.40±3.791）
26.65±3.082）
25.89±2.582）
22.18±2.042）
22.41±2.592）注：与正常对照组比较，1）P＜0.01；
与模型组比较，2）P＜0.01。

16
张敏等：归脾汤对慢性睡眠剥夺大鼠HPA轴功能及单胺类神经递质的影响第2期
4讨论
GPD是临床治疗慢性失眠重要而有效的方剂，王燕等［3］以GPD加减治疗失眠患者32例，总有效率为93.75%，证实本方能够有效改善睡眠质量。

现代研究表明：GPD能明显延长戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠时间，具有镇静催眠作用，能提高动物脑内单胺类神经递质5-羟色胺、多巴胺等含量，但其治疗慢性失眠的作用机理尚不明确［4］。

本实验采用改良水平台复制大鼠慢性睡眠剥夺模型，观察不同剂量GPD治疗慢性失眠可能的作用机制。

本实验结果表明：慢性睡眠剥夺大鼠昼夜节律紊乱，精神倦怠，皮肤色泽暗淡，毛发枯燥，喜静少动，饮食减少，体质量降低，提示模型制备成功。

经GPD治疗后，大鼠的一般状态明显改善，提示GPD具有促眠作用。

CRH、ACTH和CORT是HPA轴重要的组成激素，与睡眠密切相关。

当机体长期处于应激状态（如慢性睡眠剥夺）的情况下，会启动激素级联反应，使HPA轴亢进，损伤脑组织［5］。

临床研究表明：在慢性失眠患者中，睡眠时间少于5h的患者，CORT水平增加，总睡眠时间与CORT成反比［6］。

最新研究认为HPA轴对睡眠的影响主要取决于CRH，激活HPA轴能使ACTH和CORT的浓度增加，产生觉醒效应［7］。

本实验结果表明模型组大鼠血清和下丘脑中CRH、ACTH和CORT含量均显著升高，提示大鼠经慢性睡眠剥夺后，HPA轴功能亢进。

经GPD 治疗后，血清和下丘脑中CRH、ACTH和CORT含量显著降低，可推测GPD可通过降低CRH、ACTH和CORT含量，负反馈调节HPA轴而促睡眠，且以中剂量GPD效果较优。

此外，HPA轴还受到多种神经递质的调控，如5-HT、NE、DA等。

5-HT能神经元可以直接支配下丘脑室旁核分泌CRH，CRH的释放又受到５-HT 受体的调控，影响HPA轴功能；同时CRH、ACTH和CORT又能抑制5-HT能神经元细胞的活性，二者之间存在复杂的相互作用［8］。

MENON等［9］使用微透析技术证明单胺递质及其代谢产物在不同时长的睡眠剥夺期间发挥着重要作用。

本实验通过HPLC法检测5-HT、5-HIAA、NE和DA含量，结果表明模型组5-HT和5-HIAA明显下降，NE和DA 明显升高。

GPD治疗后能明显升高5-HT和5-HIAA含量，降低NE和DA含量，提示GPD能通过升高5-HT、5-HIAA含量，降低NE、DA含量而治疗失眠，且以中剂量GPD效果最佳。

综上，GPD能改善慢性睡眠剥夺大鼠一般状态，调节5-HT、5-HIAA、NE和DA含量，降低CRH、ACTH和CORT含量，负反馈调节HPA轴，改善HPA 轴功能亢进状态，从而治疗慢性失眠。

然而，本实验因时间、技术有限，未对慢性睡眠剥夺大鼠的睡眠时相、脑电波特征进行监测，这值得今后深入研究，为GPD的临床使用提供科学依据。

参考文献
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itary-adrenal axis activity and reactivity［J］.Stress，2010，13（1）：
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医大学学报，2017，38（6）：757-762.
［3］王燕，谭明琴，高辉.归脾汤加减治疗失眠32例［J］.光明中医，2017，32（16）：2351-2352.
［4］邓敏贞，黎同明.归脾汤对失眠小鼠镇静催眠及记忆巩固性障碍的影响［J］.中医学报，2012，27（4）：438．
［5］李春艳，王宇红，王华，等.抑郁合并失眠对大鼠HPA轴及下丘脑中氨基酸类和单胺类神经递质的影响［J］.中国药理学
通报，2021，37（6）：815-822.
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lamic-pituitary-adrenal axis in insomnia［J］.Arq Neuropsiquiatr，
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［7］李莹雪，陈贵海.慢性失眠患者血液生物学标志物的研究进展［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志，2018，25（6）：399-402.［8］杜旭，刘娟，张容超，等.逆灸对亚健康状态大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴-5-羟色胺通路的影响［J］.中医学报，2020，35（8）：
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［9］MENON J M L，NOLTEN C，ACHTERBERG E J M，et al.Brain microdialysate monoamines in relation to circadian rhythms，slee⁃
pand sleep deprivation-a systematic review，net work meta-analy⁃
sis，and new primary data［J］.J Circadian Rhythms，2019，17：1.
表3各组大鼠血浆中单胺类神经递质含量比较（xˉ±s）ng/g
组别
正常对照组模型组艾司唑仑组高剂量组中剂量组低剂量组n
8
8
8
8
8
8
5-HT
587.92±59.99
317.78±49.612）
477.93±55.964）
739.24±105.554）
541.56±58.804）
344.41±65.56
5-HIAA
1705.99±231.85
1340.00±231.722）
1782.70±118.364）
1856.16±258.334）
1666.67±179.463）
1585.65±310.34
NE
235.99±37.14
272.26±51.521）
166.34±15.454）
229.96±25.443）
208.88±18.374）
193.30±18.764）
DA
249.32±20.93
299.45±17.662）
229.38±10.934）
231.79±11.964）
243.54±18.924）
233.03±12.234）
注：与正常对照组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与模型组比较，3）P＜0.05，4）P＜0.01。

17。