关于植物脯氨酸含量测定中萃取乳化现象的探讨

总第259期2013年11月(上)The Science Education Article Collects Total.259
November 2013(A)
关于植物脯氨酸含量测定中萃取乳化现象的探讨
王征宏赵威戴凌峰(河南科技大学农学院河南·洛阳471003)
中图分类号：G642文献标识码：A 文章编号：1672-7894（2013）31-0071-02
基金项目:河南科技大学博士基金(09001427);河南科技大学实验技术开发基金项目(SY1213019);黄土高原土壤侵蚀与旱地农业国家重点实验室开放基金项目(10501-289)。

作者简介:王征宏(1976-),女,副教授,主要从事植物抗逆生理学研究。

摘要植物组织中游离脯氨酸含量的高低常常作为反映植物抗逆性强弱的一项生理指标，本文探讨分析了酸性茚三酮显色法测定该指标过程中甲苯萃取乳化现象产生的原因及其消除方法，希望能给从事该指标测定的科研工作者和学生提供参考。

关键词脯氨酸萃取乳化现象Discussion on the Extraction and Emulsification Phe 原nomenon in the Content Determination of Proline in Plant //Wang Zhenghong,Zhao Wei,Dai Lingfeng Abstract The level of free proline content in plant tissues is often regarded as a physiological index indicating the strength of plant anti-adversity.This paper explores and analyzes the reasons and elimination methods of the extraction and emulsification phe-nomenon of toluene in the process of determining the index by acidic ninhydrin colorimetry method,hoping to provide refer-ences for scientific researchers and students engaging in the de-termination of the index.Key words proline;extraction;emulsification phenomenon 在适宜的生长环境条件下，植物体内游离脯氨酸的含量较低，当遇到逆境条件时，尤其是干旱、盐渍等环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量显著增加，且抗逆性强的品种积累脯氨酸较多。

由于脯氨酸亲水性极强，这对于调节植物体渗透平衡、防止渗透胁迫对植物造成伤害、保护细胞结构具有重要的生理意义[1,2]。

因此，脯氨酸含量常常作为植物抗逆性的一项生理指标。

目前测定植物组织脯氨酸含量一般多采用酸性茚三酮显色法，该方法首先采用3%磺基水杨酸提取植物组织内的游离脯氨酸，然后在酸性条件下，游离脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，再用甲苯充分萃取脯氨酸与酸性茚三酮显色后的红色产物用于比色测定，最后可从标准曲线上查出游离脯氨酸的含量。

可是在学生具体做实验过程中，经常会出现甲苯萃取层浑浊，下层乳化的现象，使得比色的吸光度值增大而且不稳定，且甲苯有毒长时间接触会造成身体伤害。

为了达到较好的萃取分离效果且用时短，减少实验误差，降低甲苯的毒害，因此，有必要分析和探讨一下该指标测定过程中乳化现象产生的原因及其消除方法。

1萃取乳化现象萃取是利用化合物在互不相溶（或微溶）的溶剂里溶解度或分配系数不同，使化合物从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中的方法。

液-液萃取的过程实际上是一个液相中的溶质经过物理或者化学作用转移到另一相或者两相中重新分配的过程，也就是说制备不稳定乳浊液的过程。

在萃取操作过程中，一般有机相和水相混合形成的乳浊液往往是不稳定的，当外力消失后，混合液就会依靠物质自身的界面张力和比重差进行凝固和分散，如果两相混合后形成的乳
浊液难以分成清晰透明的两层，就会影响分离效果，出现这
种现象就称为萃取乳化现象[3]。

2产生乳化的原因
萃取操作过程中产生乳化现象的原因有很多，属于化学方面的原因是水相中组分析出易形成胶体的化合物或含有固体微粒，属于操作方面的原因有两相剧烈振荡或搅拌而引起液滴过度细化以及萃取操作过程中环境温度过低等，两相中任意相中含有表面活性剂类化合物往往是形成乳化现象的常见原因[4]。

总结多年的实验教学经验，我们对植物组织中游离脯氨酸含量测定过程中造成萃取乳化现象
可能的原因进行了分析和归纳。

2.1样品液不清澈
脯氨酸的提取经常采用浸提法，即取不同处理植物材料0.5g 左右，剪碎后置于大试管中，加入5mL 3%磺基水杨酸溶液，于沸水浴中浸提10min ，取出试管冷却至室温后，吸取样品提取液的上清液2mL ，加冰醋酸2mL 和酸性茚三酮3mL 沸水浴40min 进行显色，然后加甲苯萃取显色后的红色产物比色测定。

但是由于在吸取上清液过程中很容易把煮沸后的植物组织残渣也吸入到显色溶液里，而当
反应液中存在极微细的固体细粒的时候容易出现乳化现象，所以在后面甲苯萃取反应产物的时候出现甲苯层浑浊不清影响了比色测定。

2.2样品液浓度过大
脯氨酸含量测定常用的显色反应液为浓度2.5%酸性茚三酮显色液，为了更准确测定脯氨酸含量，必须保证反应液中有充足的酸性茚三酮，当样品提取液中脯氨酸浓度大于100μg ·mL -1时，建议样品提取液作适当稀释后测定[5]。

另外，当溶质浓度过高的情况也越容易发生乳化现象。

2.3萃取温度过低
当在冬季测定植物组织游离脯氨酸的含量时，由于室内温度较低，我们会发现在沸水浴中进行显色反应后，取出
试管反应液还较为澄清，但是当试管冷却至室温，再向各管
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加入甲苯萃取反应产物时，由于室内环境温度较低，反应产物在萃取剂甲苯中的溶解度降低，就会产生乳化现象。

2.4振荡或搅拌强度过大
在实验操作过程中往往采用振荡或搅拌的方法混合两相（有机相和水相）从而充分萃取水相中的化合物，但是由于有机相与水相受到剧烈振荡或搅拌，使萃取室内水力学平衡遭到了破坏，导致有机相与水相之间的界面张力下降，从而造成有机相和水相混合过于激烈而极细分散，一时难以分相而造成乳化，所以萃取分层时应该避免剧烈震荡试管。

3乳化消除方法
3.1样品液的过滤或离心
如果发现加热煮沸后样品提取液中带有细微的植物组织残渣，可以采用过滤或者3000r/min离心10min的方法得到样品上清液，然后再与酸性茚三酮进行显色反应，萃取时乳化现象即可消失。

3.2样品液的稀释
如果发现显色反应产物中出现悬浮物时，为避免甲苯萃取出现乳化现象应考虑增加甲苯的使用量或者对样品提取液适当稀释。

但增加甲苯使用量时需要延长萃取时间和增加振荡次数，而且这也仅局限于呈现极少量悬浮物时。

因此，对样品液进行适当稀释可得到较好的萃取分离效果，又可以避免增加甲苯使用量和萃取时间而造成不必要的浪费和污染。

3.3物理化学法消除乳化
萃取分层后如果发现甲苯萃取层浑浊，下层有乳化现象，可采用如下方法消除乳化。

首先因为甲苯萃取在上层，可采取加入饱和的食盐水溶液，以提高水相的密度增加水相的极性，同时又可以减少有机物在水相中的溶解度，达到消除乳化的目的。

其次，对于大部分物质来说提高体系的温度，可以使其在溶液中的溶解度增大，从而减少乳化现象的产生。

另外，对于中重度乳化现象，可以将乳浊液放到高速离心机中，进行离心分离，这种方法对于消除重度乳化现象效果比较明显且用时短。

最后为了避免比色液浑浊，在用分光光度计比色测定时注意比色杯用酒精润洗后直接用比色液润洗，不能再用蒸馏水去润洗。

4结语
我们采用上述实验操作后基本消除了酸性茚三酮显色法测定植物组织中游离脯氨酸含量时甲苯萃取后乳化浑浊的现象，分层效果较好，提高了萃取效率，缩短了萃取时间。

希望上面提到的一些注意事项能给从事该指标测定的科研工作者和学生提供参考。

参考文献
[1]赵贵林,陈强,胡国霞,等.水稻脯氨酸代谢关键酶对水分胁迫的响
应[J].干旱地区农业研究,2011,29(3):80-83.
[2]王康,刘艳香,董洁,等.盐胁迫对菊苣幼苗脯氨酸积累及其代谢途
径的影响[J].草地学报,2011,19(1):102-106.
[3]石仕国.从萃取实验中产生乳化现象引发的思考[J].快乐阅读:下
旬刊,2012(3):123.
[4]王红卫.溶剂萃取过程中产生乳化的原因及处理方法[J].有色冶
炼,1991(2):21-23.
[5]职明星,李秀菊.脯氨酸测定方法的改进[J].植物生理学通讯,2005,
41(3):355-357.
编辑王恒平
4教学实例
以项目三，多路稳压电源电路安装调试为例，做一次课程的说明：由于电源是贯穿整个电子领域最需要的东西，至少有5V、-5V、6V、12V、-12V几种电压参数。

而该电源项目电路板，除了-5V，其他常用的电压输出都有。

本项目教学展开前，学生先在机房通过教学软件理论学习整流滤波电路相关理论知识，并通过Multisim软件的使用，将桥式整流电路部分的半波整流、全波整流、滤波、稳压管稳压电路进行一次仿真测试，通过软件上的示波器进行信号波形的观察，并通过软件的万用表进行输出电压和输入电压的测试，对应于教材上的公式计算进行比较，理论知识讲解可以不用太深入，可以讲二极管的单向导电性组成了电桥。

实际工业中，用的都是桥堆模块，电容滤波的作用，除了在桥整用到外，在数字芯片的输入端滤波也同样用的很多，滤波电路的组成，了解整流电路中负载电压、纹波系数、平均整流电流、最大反向电压这些公式，设计电路时候可以参考公式设计电路，工程实际中都是凭经验和实际测量来处理。

三端稳压器的基本构成和应用进行简单的介绍，只要输入输出不出错，一般都没有问题。

当所有相应的知识点都介绍以后，并且仿真测试通过以后，就可以进行多路稳压电源电路安装调试，对于实践中的各种电子元器件要彻底了解性能和特性，比如变压器线路的连接需要做到绝缘处理，另外要注意7912的引脚，还有变压器是三抽头输出，中间是接地。

当板子焊接好以后，通过示波器，先观察桥式整流的波形，并通过示波器读数，与仿真时候的数据进行比较，另外逐步测试整套电路的各个输出电压的电压值，调试成功，即可增加负载电路。

比如之前项目二的3组9只LED流水灯电路板，将电源输出加到项目二板子上，直接观察负载电路的工作情况。

5总结
三位一体的项目教学法与传统的教学法相比，有很大的区别，主要表现在改变了传统的三个中心，由以教师为中心转变为以学生为中心，由以课本为中心转变为以“项目”为中心，由以课堂为中心转变为以实际经验为中心。

三位一体的项目教学法适用于学习各种实践性和操作性较强的知识和技能。

参考文献
[1]詹新生.高职“模拟电子技术”课程项目化教学实践[J].职教通讯,
2010(8).
[2]刘德进.提高模拟电子技术实验项目化教学质量的几点思考[J].
教育教学论坛,2011(11).
[3]王韦刚.基于Multsim的电工电子技术课程项目化教学[J].科技视
界,2012(9).
[4]付慧敏.电工电子技术课程项目化教学的探索与实践[J].产业与
科技论坛,2012(7).
编辑王恒平
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教改教法
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