基于ITS2的中药材金莲花DNA条形码鉴定研究

基于ITS2的中药材金莲花DNA条形码鉴定研究
崔欣萍; 冯佳卉; 赵春颖; 赵晴; 赵硕; 刘金欣
【期刊名称】《《承德医学院学报》》
【年(卷),期】2019(036)006
【总页数】3页(P519-521)
【关键词】中药材; 鉴定; 金莲花; DNA条形码; ITS2
【作者】崔欣萍; 冯佳卉; 赵春颖; 赵晴; 赵硕; 刘金欣
【作者单位】承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室河北承德067000; 中国医学科学院/北京协和医学院药用植物研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R282
金莲花(Trollius chinensis Bge.)是毛茛科金莲花亚科多年生草本植物的干燥花及花蕾[1]。

金莲花味微苦、性寒、无毒，具有清热解毒、滋补阴气、清热降火、抗菌消炎、养阴清热、消炎杀菌等功效[2]。

金莲花以花入药，其形态受气候环境等多种因素影响，采用传统鉴定方法具有一定局限性。

DNA条形码技术是基于遗传物质DNA对物种进行鉴定，不受生长环境、地理位置及人为因素的影响。

本研究尝试建立一种基于ITS2序列的DNA条形码鉴定方法，以期为中药材金莲花的鉴定提供参考依据。

1 材料与方法
1.1 实验材料本研究共收集11份来自河北、山西、东北等地的金莲花样品，产地信息见附表：
附表金莲花样品产地信息名称编号采集时间样品来源金莲花 JLH01 20180319 承德医学院金莲花 JLH02 20180320 承德同仁堂金莲花 JLH03 20180401 云南金莲花 JLH04 20180326 新疆阿尔泰淡紫金莲花 JLH05 20180326 新疆天山金莲花JLH06 20180323 山西五台山金莲花 JLH07 20180401 黑龙江大兴安岭淡紫金莲花 JLH08 20180417 新疆巴音布鲁克金莲花 JLH09 20180416 承德围场坝上金莲花 JLH10 20180423 承德福满家超市金莲花 JLH11 20180417 北京市药用植物研究所
1.2 金莲花DNA的提取、PCR扩增及测序每份样品取一朵干净无霉斑的完整花朵进行取样，每份取样30mg，利用植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取总DNA。

PCR扩增使用植物DNA条形码ITS2序列通
用引物和程序，PCR扩增产物经纯化后，使用ABI 3730XL测序仪进行双向序列
测定。

依据《中药材DNA条形码分子鉴定指导原则》对测序峰图质量进行判断。

1.3 数据分析利用CodonCode Aligner V7.0.1软件去除测序结果的低质量部分，并进行峰图的校对拼接，获得ITS2间隔区序列；基于隐马尔可夫模型[3](hidden Markov model )对数据进行分析，利用Hmmer V3.1软件去除5.8S区段和28S 区段获得ITS2序列；利用MEGA7.0软件构建NJ系统发育树，进行物种鉴定。

2 结果
2.1 金莲花样品DNA提取结果为考察DNA提取方法的稳定性，对编号为JLH07和JLH09的样品做了三次重复试验，共提取了15份样品的DNA。

采用NanoDrop2000c型超微量分光光度计测量DNA浓度，DNA浓度平均值为186.59ng/μl，A260/A280值在1.93～2.10之间，A260/A230值在0.85～1.44之间。

所有金莲花样品均成功提取DNA，且获得的DNA纯度较高。

2.2 PCR扩增产物检测结果通过电泳及凝胶成像检测PCR产物，所有样品均可检测到明亮、清晰的条带，产物大小为480bp。

电泳及凝胶图谱见图1：
图1 金莲花样品的电泳及凝胶图谱（1.JLH01，2.JLH02，3.JLH03，4.JLH04，5.JLH05，6.JLH06，7.JLH07，8.JLH08，9.JLH09，10.JLH10，11.JLH11，12.JLH07，13.JLH07，14.JLH09，15.JLH09；M：DM2000 DNA Maker；CK：不加DNA模板的PCR反应体系，作为空白对照）
2.3 NJ系统发育树构建通过MEGA7.0软件构建NJ树（见图2）。

将金莲花和淡紫金莲花的标准序列加入到NJ树中后，发现所有样品共分为两支，其中样品编号JLH05和JLHZ08单独聚为一支，与淡紫金莲花序列一致，其余序列与金莲花的
序列一致。

说明，基于ITS2的DNA条形码可以准确鉴定金莲花与淡紫金莲花。

图2 NJ系统发育树
3 讨论
中药品种繁多且混杂，加之大多以根茎叶花等部位局部入药，没有完整的植物形态，故依靠传统的鉴定方法对药材进行鉴定有一定的局限性。

2010年，陈士林等[4]提出将ITS2作为药用植物通用条形码，进而发现其能对物种进行快速有效地鉴别。

现如今，基于ITS2序列的DNA条形码技术已在芸香科[5]、伞形科[6]等多种科属的药用植物物种鉴定方面得到广泛应用。

徐晓兰等[7]进行了山豆根基原植物及其
混伪品的鉴定，结果表明ITS2序列可以很好地鉴定山豆根基原植物；石林春等[8]进行了天南星及其混伪品的鉴定，结果表明ITS2序列可以有效地鉴定天南星3种基原及其混伪品。

上述研究结果均提示，ITS2序列在中药材鉴定方面有一定的优
越性，为中药材的鉴定及用药安全等提供了有力支持。

本研究收集了11份金莲花样品，采用DNA条形码技术进行鉴定研究，分析获得
的ITS2序列和NJ树，发现有9份样品为金莲花，2份样品为淡紫金莲花。

本研
究证明，基于ITS2的DNA条形码技术可以准确有效地鉴别金莲花，可为中药材
金莲花的鉴定提供参考依据。

【参考文献】
【相关文献】
[1]中国医学科学院药用植物资源开发研究所.中国药用植物资源栽培学[M]北京：农业出版社，1991：1159-1163.
[2]朱殿龙，丁万隆，陈士林.金莲花属植物的研究进展[J].世界科学技术-中医药现代化，2006，
8(4)：26-33.
[3]KELLER A, SCHLEICHER T, SCHULTZ J, et al. 5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annootation[J].Gene,2009,430(1/2):50-57.
[4]陈士林，姚辉，韩建萍，等.中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[J]. 中国中药杂志，2013，38(2)：141-148.
[5]罗焜，陈士林，陈科力，等.基于芸香科的植物通用DNA条形码研究[J].中国科学，2010，
40(4)：342-358.
[6]LIU J, SHI L,HAN J,et al. Identification of species in the angiosperm family Apiaceae using DNA barcodes[J]. Mol Ecol Resour,2014，14（6）：1231-1238.
[7]徐晓兰，石林春，宋经元，等.基于ITS2条形码序列的山豆根基原植物及其混伪品的DNA分子鉴定[J].世界科学技术—中医药现代化，2012，14(1)：1147-1152.
[8]石林春，陈俊，向丽，等.基于ITS2条形码的中药材天南星及其混伪品DNA分子鉴定[J].中国中药杂志，2014，39(12)：2176-2179.。