辛伐他汀对大鼠脂肪源性干细胞的增殖和成骨分化的影响

辛伐他汀对大鼠脂肪源性干细胞的增殖和成骨分化的影响
目的观察辛伐他汀对大鼠脂肪源性干细胞的增殖及骨代谢的影响。

方法采用胶原酶消化的方法，从大鼠腹股沟脂肪中分离出脂肪干细胞，贴壁法筛选纯化细胞并体外扩增。

取第3代细胞，加入不同浓度的辛伐他汀（0μm，0.01μm，0.1μm，1μm，10μm，100μm）CCK-8检测各组的细胞增殖能力；使用RT-PCR检测相关骨向分化基因的表达；茜素红染色评价成骨诱导矿化的效果。

结果浓度低于1μm 的辛伐他汀各组可促进脂肪源性干细胞增殖（P＜0.05），高于此浓度会对细胞产生剂量依赖性的抑制作用；辛伐他汀浓度低于1μm的各组对脂肪源性干细胞成骨诱导相关基因的表达以及成骨矿化诱导有显著的促进作用（P＜0.05）。

结论一定浓度的辛伐他汀对大鼠脂肪源性干细胞的增殖和成骨分化有促进作用。

标签：辛伐他汀；脂肪源性干细胞；成骨诱导；增殖
辛伐他汀诱导骨髓间充质干细胞成骨诱导分化及增殖的作用已屡见报道，但其对脂肪源性干细胞的成骨分化是否有诱导作用还有待研究。

本实验拟使用不同浓度梯度的辛伐他汀诱导大鼠脂肪源性干细胞成骨分化，旨在从体外细胞水平探索辛伐他汀对大鼠脂肪源性干细胞成骨诱导的最佳剂量。

1 资料与方法
1.1一般资料
1.1.1主要试剂辛伐他汀（默沙东），I型胶原酶（Sigma），CCK-8（碧云天），RNAiso Plus（TAKARA），PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （TAKARA），SYBR〇R Premix Ex TaqTM II （TAKARA），茜素红S（Sigma），引物合成（上海introvigen），常规细胞培养器械。

1.1.2实验动物清洁级雄性SD大鼠12只，4～6周龄，体重100～180g。

常规手术器材，无菌手术间，动物手术台。

1.2方法
1.2.1 ADSCs的分离与纯化培养将大鼠用0.6%戊巴比妥钠（0.5ml/100g）腹腔注射麻醉，双侧腹股沟去毛，消毒铺单，取腹股沟直切口，分离皮下脂肪，操作注意无菌原则。

将约1.2g脂肪移入超净台，含2%双抗的PBS漂洗5遍，剔除结缔组织和血管，然后剪碎。

PBS冲洗2编后，加入3倍体积的0.15%I型胶原酶，37℃恒温震荡（250rpm）消化60min，待消化液浑浊。

白色液性脂肪漂浮于表层，残余组织沉淀于底层。

加入等体积的含10%FBS的低糖DMEM培养基终止消化，吹打均匀，1500r/min，离心10min，弃去上层残余脂肪及上清。

用含10%FBS+1%双抗的低糖DMEM培养基混悬细胞，70μm筛网过滤[1]。

调整细胞浓度至1×105/ML，接种于25cm2培养瓶中，37℃，5%CO2孵箱中培养。

48h 后换液，清楚漂浮细胞，之后换液1次/3d。

7～9d后细胞可生长至80%～90%融
合，之后1：3传代。

从第二代开始，消化后按每1×106个细胞每支冻存管的量冻存细胞，长期保存。

1.2.2辛伐他汀对ADSCs增殖的影响取第3代细胞，以每孔1500个细胞接种于96孔板中，每孔100ul，待细胞贴壁生长后第2d，以不同浓度的辛伐他汀（0μm，0.01μm，0.1μm，1μm，10μm，100μm）加入常规培养基中，（每组n=5孔），分别于培养0h、24 h、48h、72h后每孔加入10ul cck-8，37℃避光孵育2h，终止培养，置酶标仪上测定波长450 nm处的吸光度值。

实验重复3次。

1.2.3细胞总RNA的提取和荧光定量PCR检测ADSCs中成骨分化相关因子的表达根据增殖实验的结果，减少了对增殖有抑制作用的高浓度辛伐他汀组，共设置5组：阳性对照组和阴性对照组，以及不同浓度的辛伐他汀组（0.01μm，0.1μm，1μm）。

阳性对照组除加入常规培养基（低糖DMEM+10%FBS+1%双抗）外，还加入矿化诱导剂（100nM地塞米松+0.2nM維生素C+10mMβ-甘油磷酸钠），阴性对照组只加入常规培养基。

细胞换液1次/d，培养14d后提取细胞总RNA，用微量核酸仪测定其浓度和纯度。

取总RNA 600ng进行cDNA的合成，引物见表1。

PCR扩增反应条件为：预变性95℃30s，94℃变性5s.退火60℃34s，40个循环，95℃终末延伸15s，59℃1min，95℃15s。

反应体系为20ul。

1.2.4茜素红染色按2×104cells/孔的细胞密度接种第三代ADSCs于24孔板中，每组3孔，共5组。

分组同PCR检测。

诱导14d后，洗去培养基，4%多聚甲醛固定10min，去除固定液，漂洗后加入茜素红染色液37℃染色20min，洗去残留染色液，镜下观察。

然后再利用等量5%SDS-盐酸溶液洗脱茜素红，混匀后取100ul上酶标仪读取OD值，统计分析结果。

1.3统计学分析结果以均数±标准差（x±s）表示，并采用SPSS 13.0软件进行数据整理和统计。

使用单因素方差分析进行分析，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果
2.1 ADSCs的形态学观察接种ADSCs原代细胞24h后，可见细胞贴壁，胞体较小，星形，单核，有漂浮的脂肪液滴。

48h后贴壁细胞数量增多，少数细胞呈集落生长，细胞呈梭形、形态不规则，细胞体积进一步增大。

72h后细胞呈典型的成纤维细胞样生长，部分聚集成团。

培养7d后，梭形细胞生长速度加快，细胞密度接近80%，此时可传代。

见图1。

图1 ADSCs传代第3代
2.2不同浓度辛伐他汀对ADSCs增殖的影响CCK-8检测表明，0.01μm/L组、0.1μm/L组的ADSCs的增殖活性明显增加，0.01μm/L组的细胞增殖能力最强。

但当继续增加辛伐他汀浓度时，其促进ADSCs的能力呈下降趋势，其中1μm/L 组与对照组相比，ADSCs的增殖能力无明显差异，10μm/L组对ADCSs的增殖有明显的抑制作用。

各组ADSCs的增殖曲线见图2。

图2 CCK-8检测不同浓度辛伐他汀刺激下ADSCs的增殖曲线
2.3 ADSCs在不同浓度辛伐他汀诱导下的成骨相关基因表达变化为了检测ADSCs的骨形成能力，我们检测了多个具有代表性的成骨相关基因，见图3。

根据CCK-8的实验结果提示10μm/L浓度的辛伐他汀对ADSCs的增殖有明显的抑制作用，因此我们调整了分组，在本部分实验中去除了10μm/L浓度组，阳性对照组中加入成骨诱导培养基。

我们发现0.01μm组、0.1μm组、1μm组均能上调成骨相关基因的表达。

图3 成骨相关基因的表达情况
2.4辛伐他汀对ADSCs分化的影响不同浓度辛伐他汀对大鼠脂肪干细胞的矿化诱导作用如图3所示。

0.01μm、0.1μm、1μm和阳性对照组与阴性对照组相比其茜素红阳性的矿化结节更高（P＜0.05），0.01μm组比阳性对照组高（P＜0.05）。

0.01μm浓度的辛伐他汀对ADCSs的成骨矿化诱导有显著的促进作用。

见图4、图5。

图4 诱导14d后茜素红染色。

图为0.01μm组染色结果。

图5 茜素红染色定量分析
注：*：P＜0.05 各组与阴性对照组比较；#：P＜0.05 0.01μm与阳性对照组比较
3 讨论
近年来，随着干细胞研究的发展，脂肪源性干细胞越来越多的受到人们的关注。

自从Zuk第一次从脂肪组织中提取出具有与骨髓间充质干细胞（bone marow mesenchymal stem cels，BMSCs）相似的多向分化性能的成体干细胞，并命名为脂肪组织提取物（processed lipoaspirate cells，PLA）开始[2]，对脂肪干细胞的研究就从未停止过。

脂肪组织来源于中胚层，在各种组织中广泛，皮下尤其丰富，所以脂肪组织分离ADSCs相对简单。

由于其中胚层来源的属性，理论上ADSCs 具有跨胚层向其他胚层细胞多向分化的潜能[3]。

ADSCs组织相容性好，能在维持良好的生物相容性同时不引起免疫排斥反应。

芬兰口腔外科医师将一名患者的自体脂肪干细胞异位诱导成骨修复上颌骨大面积骨缺损，并获得了良好的疗效
[4]。

有研究把ADSCs注入小鼠皮下观察其致瘤作用，在1年时间内未发现成瘤
[5]，但其远期的生物安全性还有待进一步研究。

他汀类药物除具有调脂功能以外，还具有改善血管内皮功能、减轻血管炎症反应等作用[6，7]。

他汀类药物特别是辛伐他汀，对骨髓间充质干细胞的成骨分化有促进作用。

对多种成骨细胞株的体外成骨也有一定的促进作用。

那么对于脂肪源性干细胞，辛伐他汀是否能够发挥类似的促成骨作用？为了回答这个问题，我们通过体外实验确定不同浓度辛伐他汀对大鼠脂肪干细胞增殖能力的影响，然后确定不同浓度辛伐他汀对大鼠脂肪干细胞成骨分化能力的影响。

本实验中CCK-8检测结果提示10μm浓度的辛伐他汀对大鼠脂肪干细胞的增殖表现出明显
的抑制作用，在0.01μm和0.1μm浓度辛伐他汀对ADSCs表现出一定的促增殖作用。

在BMMSCs的相关研究中提示高于1μm浓度的他汀类药物对BMMSCs 将表现出细胞毒性，从而引起部分BMMSCs死亡[8]。

本研究发现辛伐他汀对脂肪干细胞增殖的影响与BMMSCs类似。

我们研究发现0.01μm、0.1μm、1μm辛伐他汀能够在不抑制脂肪源性干细胞增殖的同时不同程度的上调OC、BMP-2、Smad1、RUNX2、VEGFa等成骨相关基因，诱导成骨分化及矿化。

我们通过体外检测不同浓度辛伐他汀对脂肪源性干细胞的增殖和成骨定向诱导分化的影响，发现脂肪源性干细胞在成骨诱导分化潜能上与骨髓间充质干细胞类似，辛伐他汀对干细胞成骨诱导分化的作用可能具有普遍性而非组织特异性，其具体的作用位点和下游信号通路是否与骨髓间充质干细胞类似还有待进一步确定。

但是在辛伐他汀口服及静脉注射等多种给药途径的动物实验中其对于骨髓源性干细胞并不能展现出与体外实验相类似的效应，具体原因与可能与辛伐他汀的体内代谢降解或组织分布有关。

在体内，辛伐他汀对脂肪源性干细胞的成骨定向诱导分化是否具有作用，以及其具体的有效浓度、剂量和具体给药途径，我们还需进行更深入的实验。

有相关研究尝试将辛伐他汀用于辅助糖尿病干细胞移植等其他非骨器官的干细胞移植，因本研究证实辛伐他汀的成骨诱导作用，因此对于这类研究的前景我们持保守态度。

有研究认为他汀类药物能够通过激活成骨细胞的BMP-2启动子，从而上调BMP-2基因的表达，进而发挥增强骨修复的生物学功能，提示辛伐他汀可能通过Ras/Smad/Erk/BMP-2的信号通路，调节成骨分化。

局部应用辛伐他汀能够提高局部BMP-2和VEGF的基因表达，这与我们的研究结果一致。

综上所述，本研究为辛伐他汀在脂肪干细胞移植治疗成骨障碍方面提供了实验依据。

由于辛伐他汀的安全性、易获取性、促成骨效果明确等优点，其在高效促进组织工程化骨的实际应用方面将发挥更为深远的作用。

参考文献：
[1]Eom，Y.W.，et al.，Rapid isolation of adipose tissue-derived stem cells by the storage of lipoaspirates[J].Yonsei Med J，2011. 52（6）：999-1007.
[2]Zuk，P.A.，et al.，Multilineage cells from hμman adipose tissue：implications for cell-based therapies[J].Tissue Eng，2001，7（2）：211-28.
[3]Martinez-Conesa，E.M.，et al.，Characterization of ocular surface epithelial and progenitor cell markers in hμman adipose stromal cells derived from lipoaspirates[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2012，53（1）：513-20.
[4]Mesimaki，K.，et al.，Novel maxillary reconstruction with ectopic bone formation by GMP adipose stem cells[J].Int J Oral Maxillofac Surg，2009，38（3）：201-209.
[5]MacIsaac，Z.M.，et al.，Long-term in-vivo tμmorigenic assessment of hμman culture-expanded adipose stromal/stem cells[J].Exp Cell Res，2012，318（4）：416-423.
[6]Endres，M.，Statins：potential new indications in inflammatory conditions[J].Atheroscler Suppl，2006，7（1）：31-35.
[7]Hong，M.K.，et al.，Usefulness of follow-up low-density lipoprotein cholesterol level as an independent predictor of changes of coronary atherosclerotic plaque size as determined by intravascular ultrasound analysis after statin （atorvastatin or simvastatin）therapy[J].Am J Cardiol，2006，98（7）：866-670.
[8]Kupcsik，L.，et al.，Statin-induced calcification in hμman mesenchymal stem cells is cell death related[J].J Cell Mol Med，2009. 13（11-12）：4465-4473.
編辑/哈涛。