色谱简述及血浆分离分析
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②顶空气进样/液上相[GC]
2mL全血分析（由于乙醇在固液两相分配比不等同）→ 恒温水浴60min（乙醇在气液两相间分配）→ 分配平衡后，取60μL顶空气进行分析
③沉淀蛋白进样
甲醇、乙腈、三氯醋酸，使用极性很大的目标物
进样量： 1-20μL
色谱分析过程
步骤
预处理
进样
色谱分析
效果检验
回收率 检出限
进一步检测
萃取样品峰面积之比
日间：要求在15%以内
物质的最小浓度或最小量
>98%
0.5-2.9%(n=5)
0.2-1nmol
25min
脂肪酸
86-100%
日内0.69-5.05% 日间0.44-4.62%
100-300ng/mL
(预处 理)+15min
各种常见毒品 药品(伏立康唑)
96-103% 99-103%
对溶剂亲和力不同）的分配比。 • 萘呋胺用甲酸进行调节pH后分离效果提高咖啡因，咪哒唑仑及代谢物：
• 检测头孢哌酮钠时，当甲醇与水的比例为25:75时,保 留时间较合适,各组分能完全分离。
• 检测毒品时65%三氯甲烷-甲醇最佳。 • 检测丙吡胺及其代谢物时，采用48%甲醇可使各组分
的分离及峰形较为满意
温度
检测条件：叶酸在柱温25℃荧光强度最强 升温：降低了柱压力,且可适当提高流速, 缩短了组
N2吹干，复溶 主要在毒品、药物检测中用到，用于浓缩提纯 如脂肪酸跳过这一步是因为物质高挥发性，N2吹干复溶会降低含量
关键影响因素调节
极性
柱前衍化：脂肪酸预处理时加入KOH-甲醇皂化衍生， 生成脂肪酸甲酯，增加极性
调节流动相：极性低时，杂峰多，各组分容量因子小， 色谱峰重叠，分离效果不佳；极性高时保留时间增加
01
药动学
药物吸收代谢等
①重组酶和研究药物孵育：测定药物及代谢产物浓度，推定参与药物代谢的酶； ②抑制试验：在①基础上，测定加入酶的底物是否抑制药物及代谢产物浓度。 以反相高效液相色谱为主。
02
临床用药
03
刑事司法
血药浓度，氨基酸、脂肪酸等分析，生物利用度、生物等效性等
生物利用度：相同剂量不同剂型效果； 生物等效性：新旧药效果对比； 关注药时曲线下面积(AUC)、峰浓度(CMAX)达峰时间(TMAX)。 以反相高效液相色谱为主。
1.白蛋白类 狂犬病人血白蛋白、乙型肝炎、人胎盘血白蛋白
2.免疫球蛋白类 肌注人免疫球蛋白、抗人淋巴细胞免疫球蛋白、破伤风免疫球蛋白
3.凝血因子类 冻干人凝血酶、抗凝血酶Ⅲ、人凝血因子Ⅷ
4.微量蛋白类
*所列均为已列入2000年版“ 中国生物制品规程 ” 的制品
分离纯化方法
原理 白蛋白 免疫球蛋白 抗凝血酶
离子交换色谱
离子交换色谱使用的是低交换 容量的离子交换剂，这种交换 剂的表面有离子交换基团。
带负电荷的交换基团（如磺酸基 和羧酸基）可以用于阳离子的分 离，带正电荷的交换基团（如季 胺盐）可以用于阴离子的分离。
离子对色谱
将一种或多种与目标离子电荷相反的离子（离子或反粒子）对试剂加到样品溶 液或流动相中，使其与目标离子结合形成疏水性离子对化合物，以便能够在两 相之间进行分配。
分保留时间,峰形变锐 • 脂肪酸：程序升温 • 毒品：程序升温（100-260℃，15℃/min） • 头孢哌酮钠：柱恒温加热45℃ ,
pH
衍生条件：氨基酸OPA荧光衍生要求pH10.5，且不能用磺基水杨酸调节 检测条件：叶酸在pH5.4下强度最强 洗脱条件：叶酸pH3.6洗脱才能杂质最少 分离效果与稳定性：调节pH来改变弱酸性弱碱性药物（分子和离子状态
离子交换
离子亲和力 蟾蜍血清分离白蛋白
亲和色谱
特异性结合 燃料配基亲和色谱
比较成熟，依赖各种蛋白等电点的差异性
4 Protein A/G 蛋白亲和色谱技术
水蛭素抗凝血酶
蛇血浆纯化抗凝血酶
二.血浆中小分子定量分析
色谱在血浆中小分子定量分析的应用
用途
内源性活性化合物浓度很低(ng/L~μg/L)，而色谱方法高效、高灵敏度、分析速度快、用量少。
用于多种理化性质相近的药物分离进行定性定量分析，主要针对挥发性物质，相对便宜方便易普及。 如：乙醇，常见毒品，脂肪酸
高效液相色谱(HPLC)
治理药物监测最常用的方法，可同时进行几种药物定性定量分析和药动学。 对于GC不能分析的高熔点，低挥发性，极性强，热不稳定物质可以适用。 常用方法： ①反相高效液相色谱(RP-HPLC)，应用最广泛，如：各种氨基酸、叶酸(维生素)、大部分药物监测(抗生素— —头孢哌酮钠、伏立康唑，心血管药——丙吡胺及其代谢物、萘呋胺，抗癌药——5-Fu，探针药——咖啡因， 咪哒唑仑及代谢物) ②亲水相互作用(HILIC)，如：赖氨酸，NKK及代谢物(致癌物质) （如第一部分，血红蛋白用亲和层析/离子交换色谱) 检测器： ①紫外（适用多数物质有紫外吸收，检测限1ng）,如：5-Fu ②荧光（适用能产生荧光的物质，检测限0.1ng），如：萘呋胺，半胱氨酸 ③电化学（适用儿茶酚胺和含酚性基团的药物及代谢产物）
在正相离子对色谱中，要求对离子能较 强地吸附在固定相表面上，不易洗脱下 来，在色谱柱内生成的离子对缔合物只 溶于流动相的有机溶剂内，而不溶于水。 当色谱柱使用一定时间后由于对离子的 流失或pH值的变化，会使柱效降低，则 需重新涂渍对离子和固定液，进行再生。
在绝大多数反相离子对色谱都 是在非极性的烷基键合相上完 成的。含有对离子的极性流动 相不断通过色谱柱，与样品离 子生成疏水性的离子对，后者 在疏水固定相表面分配或吸附， 然后再被流动相洗脱下来。
1.64-6.32%
日内3.2-4.0% 日间2.6-3.8%
0.05mg/kg 0.1mg/L
18min 10min
色谱分析过程
步骤
预处理
进样
色谱分析
效果检验
回收率 检出限
进一步检测
标准曲线
样品检测
进样
过程图
进样方法:
①直接进样
适合RC-HPLC，样品浓度大，蛋白含量少，无污染 GC应用快速，但容易污染和堵塞
原理：依据化合物之间的特异性生 物化学相互作用（如抗原和抗体、 酶和底物、受体和配体等）的差异 而实现分离
亲和色谱
固定相：载体表面键合上一种特 殊基团（配基），这种固载化的 基团将只能和具有亲和力特性吸 附的蛋白质等生物大分子作用而 实现分离。
间隔基：环氧、联胺等 配基：酶、抗原等
这种固载化的配基将只能和具 有亲和特性吸附的生物大分子 作用。
体积排阻色谱
利用多孔凝胶固定相的独特特 性，而产生的一种主要依据分 子尺寸大小的差异来进行分离 的方法 。
凝胶过滤色谱法 ：以水溶液作 流动相的体积排阻色谱法。
凝胶渗透色谱法 ：以有机溶剂 作为流动相的体积排阻色谱法。
亲和色谱
分类：免疫亲和色谱、固定化金属 离子亲和色谱、基于标签的亲和色 谱、凝集素亲和色谱。
色谱简述及血浆分离分析
01 色谱简述 按照分离原理分类
液相色谱
吸附色谱 液-液分配色谱 离子交换色谱
离子对色谱 体积排阻色谱
亲和色谱 亲水相互作用色谱
分子量<2000 样 品
溶于有机溶剂 溶于水
分子量>2000
体积排阻色谱
凝胶渗透色谱 吸附色谱 离子交换色谱 分配色谱
凝胶过滤色谱
凝胶过滤色谱 凝胶渗透色谱
刑事案件，司法鉴定，毒品鉴定
血液中乙醇，麻醉剂，兴奋剂等检测。以气相色谱为主。
色谱分析过程
过程图
色谱分析过程
步骤
预处理
进样
色谱分析
效果检验
回收率 检出限
进一步检测
标准曲线
样品检测
色谱分析过程
步骤
预处理
进样
色谱分析
效果检验
回收率 检出限
进一步检测
标准曲线
样品检测
常用色谱分析方法
01 02
03
气相色谱(GC)
标准曲线
样品检测
预处理
目标：去除杂质，提高分析精度和分离效果；提高检测灵敏度；提高样品与流动相兼容性，改善重复性。
柱前柱后衍化 1.氨基酸: 柱前衍生，先加OPA再加FMOC→荧光检测 2.脂肪酸: KOH-甲醇/乙醇皂化衍生→低沸点易挥发 3.叶酸: 6W紫外灯10cm照射50min→荧光检测
调节酸碱 加入HCl/NaOH/甲酸水溶液等
色谱分析过程
步骤
预处理
进样
色谱分析
效果检验
回收率 检出限
进一步检测
标准曲线
样品检测
色谱分析过程
步骤
预处理
进样
色谱分析
效果检验
回收率 检出限
进一步检测
标准曲线
样品检测
萃取效果检验（文献中）
原理 各种氨基酸
回收率
日内、间变异系数RSD
检出限
分析时间
萃取样品与同浓度非 日内：争取5％以内，不能超过10% 给定置信度内可检出待测
比较项目 固定相 流动相 流出次序
正相色谱 极性
非（弱）极性 非极性>极性
流动相极性的影响 极性增大作用力减小
分离组分的差异 溶质极性基团的差异
反相色谱 非极性
极性 极性>非极性 极性增大作用力增大 溶质非极性基团的差异
离子交换色谱
原理：利用不同离子在给定离子交换剂上亲和力大小 的不同而进分离的方法
分配色谱
原理：组分在固定相和流动相中分配的差异，分离过程是一 个分配平衡过程。
化学键合固定相： a.硅氧碳键型： ≡Si—O—C b.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C c.硅碳键型： ≡Si—C d.硅氮键型： ≡Si—N
硅胶基质表面固定相固定方式示意图： （a）包覆/（b）键合。
正相色谱和反相色谱
蛋白沉淀 & 萃取 超滤、有机溶剂或强酸处理，如甲醇、乙腈、三氯醋酸等处理，取上清液使用。 （上清液要保证足够水稀释，以防止组分流失） 适用于极性目标物，如氨基酸、极性衍化后脂肪酸、毒品和部分药物检验。 蛋白沉淀法较固相萃取法简单方便便宜。
内标法 主要在药物检测中用到，赖氨酸、半胱氨酸、乙醇等也需要 如测乙醇时以正丙醇为内标物，以酒精/内标物峰面积比监测血液中酒精含量
亲水相互作用色谱
HILIC作为一种分离极性化合物的液相色谱 模式，与正相色谱类似, 在HILIC 模式下化 合物的保留时间随化合物极性的增强而增加。
HILIC柱上的洗脱顺序与RPLC柱上的正好相 反：
极性较小的物质先出峰 极性较大的物质后出峰
亲水相互作用色谱
HILIC模式的分离机理不是十分明确,存在着多种复杂的相互作用。溶 质除了在流动相和固定相表面水层中的分配作用以外,还存在与固定相 直接的相互作用。例如,多篇文献报道证实了多种HIL-IC固定相与溶质 分子发生静电相互作用,而且对色谱保留性质产生十分重要的影响[1，2]。 另外,溶质与固定相直接的氢键相互作用和偶极作用也存在于HILIC模 式中[3]。
提纯人血清白蛋白
改进
色谱发展
基于低温乙醇法： Cohn6+9 & Nitschmann-Kistler
硫酸铵盐析法和利凡诺沉淀法 (提取白蛋白、丙种球蛋白)
凝胶过滤、离子交换和 亲和层析技术
层析法和低温乙醇法有 效结合
目前我国生产主流
目前世界生产主流：
基因工程
血液制品分类
血浆中现明确分子结构的蛋白有100余种，已经分离并使用于临床的有20余种. 从功能上(按研发和用于临床的先后顺序)可以主要分为：
吸附色谱
利用吸附剂对不同组分 吸附性能的差别即吸附 系数的不同而进行分离 的方法。
多属于物理吸附，吸附 剂通过范德华力（固体 表面的作用力、氢键络 合、静电引力）吸附成 分。
吸附色谱
氧化铝：Al3+作为活性中心 硅胶：Si-OH键作为活性中心 聚酰胺：半化学吸附 通过氢键力吸附
洗脱顺序：非极性化合物先于极性化合物
[1]StregeMA.AnalChem,1998,70(13):2439 [2]GuoY,GaikiS.JChromatogrA,2005,1074(1/2):71 [3] LiuY,UrgaonkarS,VerkadeJG,etal.JChromatogrA,2005,1079(1/2):146
①亲水性的固定相 ②流动相含高比例的有机溶剂的含水溶 剂(通常是乙腈，其中水是强洗脱溶剂) ③和有机溶剂相容性较好的挥发性的缓 冲盐，如乙酸铵、甲酸铵和碳酸铵等
02
色谱在血浆物质提纯分析中的应用
色谱技术对血浆中的目标蛋白质和目标小分子进行分离纯化和定量分析
一.分离纯化血液制品
分离纯化血液制品
低温乙醇法
液质联用(HPLC-MS)
研究复杂成分药物体内代谢更敏感特异高效，无需大量对照品，昂贵操作复杂，短期内难普及。 多选用电喷雾正离子模式(ESI+),多反应监测(MRM) 其他联用还有高效液相色谱一核磁共振联用(HPLC—NMR)、气相色谱一质谱联用(GC—Ms)等。 如：HILIC-MS/MS：NKK及代谢物，GC—Ms：多种常见毒品，RP-HPLC-MS/MS：咖啡因，咪哒唑仑及代谢物。
2mL全血分析（由于乙醇在固液两相分配比不等同）→ 恒温水浴60min（乙醇在气液两相间分配）→ 分配平衡后，取60μL顶空气进行分析
③沉淀蛋白进样
甲醇、乙腈、三氯醋酸，使用极性很大的目标物
进样量： 1-20μL
色谱分析过程
步骤
预处理
进样
色谱分析
效果检验
回收率 检出限
进一步检测
萃取样品峰面积之比
日间：要求在15%以内
物质的最小浓度或最小量
>98%
0.5-2.9%(n=5)
0.2-1nmol
25min
脂肪酸
86-100%
日内0.69-5.05% 日间0.44-4.62%
100-300ng/mL
(预处 理)+15min
各种常见毒品 药品(伏立康唑)
96-103% 99-103%
对溶剂亲和力不同）的分配比。 • 萘呋胺用甲酸进行调节pH后分离效果提高咖啡因，咪哒唑仑及代谢物：
• 检测头孢哌酮钠时，当甲醇与水的比例为25:75时,保 留时间较合适,各组分能完全分离。
• 检测毒品时65%三氯甲烷-甲醇最佳。 • 检测丙吡胺及其代谢物时，采用48%甲醇可使各组分
的分离及峰形较为满意
温度
检测条件：叶酸在柱温25℃荧光强度最强 升温：降低了柱压力,且可适当提高流速, 缩短了组
N2吹干，复溶 主要在毒品、药物检测中用到，用于浓缩提纯 如脂肪酸跳过这一步是因为物质高挥发性，N2吹干复溶会降低含量
关键影响因素调节
极性
柱前衍化：脂肪酸预处理时加入KOH-甲醇皂化衍生， 生成脂肪酸甲酯，增加极性
调节流动相：极性低时，杂峰多，各组分容量因子小， 色谱峰重叠，分离效果不佳；极性高时保留时间增加
01
药动学
药物吸收代谢等
①重组酶和研究药物孵育：测定药物及代谢产物浓度，推定参与药物代谢的酶； ②抑制试验：在①基础上，测定加入酶的底物是否抑制药物及代谢产物浓度。 以反相高效液相色谱为主。
02
临床用药
03
刑事司法
血药浓度，氨基酸、脂肪酸等分析，生物利用度、生物等效性等
生物利用度：相同剂量不同剂型效果； 生物等效性：新旧药效果对比； 关注药时曲线下面积(AUC)、峰浓度(CMAX)达峰时间(TMAX)。 以反相高效液相色谱为主。
1.白蛋白类 狂犬病人血白蛋白、乙型肝炎、人胎盘血白蛋白
2.免疫球蛋白类 肌注人免疫球蛋白、抗人淋巴细胞免疫球蛋白、破伤风免疫球蛋白
3.凝血因子类 冻干人凝血酶、抗凝血酶Ⅲ、人凝血因子Ⅷ
4.微量蛋白类
*所列均为已列入2000年版“ 中国生物制品规程 ” 的制品
分离纯化方法
原理 白蛋白 免疫球蛋白 抗凝血酶
离子交换色谱
离子交换色谱使用的是低交换 容量的离子交换剂，这种交换 剂的表面有离子交换基团。
带负电荷的交换基团（如磺酸基 和羧酸基）可以用于阳离子的分 离，带正电荷的交换基团（如季 胺盐）可以用于阴离子的分离。
离子对色谱
将一种或多种与目标离子电荷相反的离子（离子或反粒子）对试剂加到样品溶 液或流动相中，使其与目标离子结合形成疏水性离子对化合物，以便能够在两 相之间进行分配。
分保留时间,峰形变锐 • 脂肪酸：程序升温 • 毒品：程序升温（100-260℃，15℃/min） • 头孢哌酮钠：柱恒温加热45℃ ,
pH
衍生条件：氨基酸OPA荧光衍生要求pH10.5，且不能用磺基水杨酸调节 检测条件：叶酸在pH5.4下强度最强 洗脱条件：叶酸pH3.6洗脱才能杂质最少 分离效果与稳定性：调节pH来改变弱酸性弱碱性药物（分子和离子状态
离子交换
离子亲和力 蟾蜍血清分离白蛋白
亲和色谱
特异性结合 燃料配基亲和色谱
比较成熟，依赖各种蛋白等电点的差异性
4 Protein A/G 蛋白亲和色谱技术
水蛭素抗凝血酶
蛇血浆纯化抗凝血酶
二.血浆中小分子定量分析
色谱在血浆中小分子定量分析的应用
用途
内源性活性化合物浓度很低(ng/L~μg/L)，而色谱方法高效、高灵敏度、分析速度快、用量少。
用于多种理化性质相近的药物分离进行定性定量分析，主要针对挥发性物质，相对便宜方便易普及。 如：乙醇，常见毒品，脂肪酸
高效液相色谱(HPLC)
治理药物监测最常用的方法，可同时进行几种药物定性定量分析和药动学。 对于GC不能分析的高熔点，低挥发性，极性强，热不稳定物质可以适用。 常用方法： ①反相高效液相色谱(RP-HPLC)，应用最广泛，如：各种氨基酸、叶酸(维生素)、大部分药物监测(抗生素— —头孢哌酮钠、伏立康唑，心血管药——丙吡胺及其代谢物、萘呋胺，抗癌药——5-Fu，探针药——咖啡因， 咪哒唑仑及代谢物) ②亲水相互作用(HILIC)，如：赖氨酸，NKK及代谢物(致癌物质) （如第一部分，血红蛋白用亲和层析/离子交换色谱) 检测器： ①紫外（适用多数物质有紫外吸收，检测限1ng）,如：5-Fu ②荧光（适用能产生荧光的物质，检测限0.1ng），如：萘呋胺，半胱氨酸 ③电化学（适用儿茶酚胺和含酚性基团的药物及代谢产物）
在正相离子对色谱中，要求对离子能较 强地吸附在固定相表面上，不易洗脱下 来，在色谱柱内生成的离子对缔合物只 溶于流动相的有机溶剂内，而不溶于水。 当色谱柱使用一定时间后由于对离子的 流失或pH值的变化，会使柱效降低，则 需重新涂渍对离子和固定液，进行再生。
在绝大多数反相离子对色谱都 是在非极性的烷基键合相上完 成的。含有对离子的极性流动 相不断通过色谱柱，与样品离 子生成疏水性的离子对，后者 在疏水固定相表面分配或吸附， 然后再被流动相洗脱下来。
1.64-6.32%
日内3.2-4.0% 日间2.6-3.8%
0.05mg/kg 0.1mg/L
18min 10min
色谱分析过程
步骤
预处理
进样
色谱分析
效果检验
回收率 检出限
进一步检测
标准曲线
样品检测
进样
过程图
进样方法:
①直接进样
适合RC-HPLC，样品浓度大，蛋白含量少，无污染 GC应用快速，但容易污染和堵塞
原理：依据化合物之间的特异性生 物化学相互作用（如抗原和抗体、 酶和底物、受体和配体等）的差异 而实现分离
亲和色谱
固定相：载体表面键合上一种特 殊基团（配基），这种固载化的 基团将只能和具有亲和力特性吸 附的蛋白质等生物大分子作用而 实现分离。
间隔基：环氧、联胺等 配基：酶、抗原等
这种固载化的配基将只能和具 有亲和特性吸附的生物大分子 作用。
体积排阻色谱
利用多孔凝胶固定相的独特特 性，而产生的一种主要依据分 子尺寸大小的差异来进行分离 的方法 。
凝胶过滤色谱法 ：以水溶液作 流动相的体积排阻色谱法。
凝胶渗透色谱法 ：以有机溶剂 作为流动相的体积排阻色谱法。
亲和色谱
分类：免疫亲和色谱、固定化金属 离子亲和色谱、基于标签的亲和色 谱、凝集素亲和色谱。
色谱简述及血浆分离分析
01 色谱简述 按照分离原理分类
液相色谱
吸附色谱 液-液分配色谱 离子交换色谱
离子对色谱 体积排阻色谱
亲和色谱 亲水相互作用色谱
分子量<2000 样 品
溶于有机溶剂 溶于水
分子量>2000
体积排阻色谱
凝胶渗透色谱 吸附色谱 离子交换色谱 分配色谱
凝胶过滤色谱
凝胶过滤色谱 凝胶渗透色谱
刑事案件，司法鉴定，毒品鉴定
血液中乙醇，麻醉剂，兴奋剂等检测。以气相色谱为主。
色谱分析过程
过程图
色谱分析过程
步骤
预处理
进样
色谱分析
效果检验
回收率 检出限
进一步检测
标准曲线
样品检测
色谱分析过程
步骤
预处理
进样
色谱分析
效果检验
回收率 检出限
进一步检测
标准曲线
样品检测
常用色谱分析方法
01 02
03
气相色谱(GC)
标准曲线
样品检测
预处理
目标：去除杂质，提高分析精度和分离效果；提高检测灵敏度；提高样品与流动相兼容性，改善重复性。
柱前柱后衍化 1.氨基酸: 柱前衍生，先加OPA再加FMOC→荧光检测 2.脂肪酸: KOH-甲醇/乙醇皂化衍生→低沸点易挥发 3.叶酸: 6W紫外灯10cm照射50min→荧光检测
调节酸碱 加入HCl/NaOH/甲酸水溶液等
色谱分析过程
步骤
预处理
进样
色谱分析
效果检验
回收率 检出限
进一步检测
标准曲线
样品检测
色谱分析过程
步骤
预处理
进样
色谱分析
效果检验
回收率 检出限
进一步检测
标准曲线
样品检测
萃取效果检验（文献中）
原理 各种氨基酸
回收率
日内、间变异系数RSD
检出限
分析时间
萃取样品与同浓度非 日内：争取5％以内，不能超过10% 给定置信度内可检出待测
比较项目 固定相 流动相 流出次序
正相色谱 极性
非（弱）极性 非极性>极性
流动相极性的影响 极性增大作用力减小
分离组分的差异 溶质极性基团的差异
反相色谱 非极性
极性 极性>非极性 极性增大作用力增大 溶质非极性基团的差异
离子交换色谱
原理：利用不同离子在给定离子交换剂上亲和力大小 的不同而进分离的方法
分配色谱
原理：组分在固定相和流动相中分配的差异，分离过程是一 个分配平衡过程。
化学键合固定相： a.硅氧碳键型： ≡Si—O—C b.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C c.硅碳键型： ≡Si—C d.硅氮键型： ≡Si—N
硅胶基质表面固定相固定方式示意图： （a）包覆/（b）键合。
正相色谱和反相色谱
蛋白沉淀 & 萃取 超滤、有机溶剂或强酸处理，如甲醇、乙腈、三氯醋酸等处理，取上清液使用。 （上清液要保证足够水稀释，以防止组分流失） 适用于极性目标物，如氨基酸、极性衍化后脂肪酸、毒品和部分药物检验。 蛋白沉淀法较固相萃取法简单方便便宜。
内标法 主要在药物检测中用到，赖氨酸、半胱氨酸、乙醇等也需要 如测乙醇时以正丙醇为内标物，以酒精/内标物峰面积比监测血液中酒精含量
亲水相互作用色谱
HILIC作为一种分离极性化合物的液相色谱 模式，与正相色谱类似, 在HILIC 模式下化 合物的保留时间随化合物极性的增强而增加。
HILIC柱上的洗脱顺序与RPLC柱上的正好相 反：
极性较小的物质先出峰 极性较大的物质后出峰
亲水相互作用色谱
HILIC模式的分离机理不是十分明确,存在着多种复杂的相互作用。溶 质除了在流动相和固定相表面水层中的分配作用以外,还存在与固定相 直接的相互作用。例如,多篇文献报道证实了多种HIL-IC固定相与溶质 分子发生静电相互作用,而且对色谱保留性质产生十分重要的影响[1，2]。 另外,溶质与固定相直接的氢键相互作用和偶极作用也存在于HILIC模 式中[3]。
提纯人血清白蛋白
改进
色谱发展
基于低温乙醇法： Cohn6+9 & Nitschmann-Kistler
硫酸铵盐析法和利凡诺沉淀法 (提取白蛋白、丙种球蛋白)
凝胶过滤、离子交换和 亲和层析技术
层析法和低温乙醇法有 效结合
目前我国生产主流
目前世界生产主流：
基因工程
血液制品分类
血浆中现明确分子结构的蛋白有100余种，已经分离并使用于临床的有20余种. 从功能上(按研发和用于临床的先后顺序)可以主要分为：
吸附色谱
利用吸附剂对不同组分 吸附性能的差别即吸附 系数的不同而进行分离 的方法。
多属于物理吸附，吸附 剂通过范德华力（固体 表面的作用力、氢键络 合、静电引力）吸附成 分。
吸附色谱
氧化铝：Al3+作为活性中心 硅胶：Si-OH键作为活性中心 聚酰胺：半化学吸附 通过氢键力吸附
洗脱顺序：非极性化合物先于极性化合物
[1]StregeMA.AnalChem,1998,70(13):2439 [2]GuoY,GaikiS.JChromatogrA,2005,1074(1/2):71 [3] LiuY,UrgaonkarS,VerkadeJG,etal.JChromatogrA,2005,1079(1/2):146
①亲水性的固定相 ②流动相含高比例的有机溶剂的含水溶 剂(通常是乙腈，其中水是强洗脱溶剂) ③和有机溶剂相容性较好的挥发性的缓 冲盐，如乙酸铵、甲酸铵和碳酸铵等
02
色谱在血浆物质提纯分析中的应用
色谱技术对血浆中的目标蛋白质和目标小分子进行分离纯化和定量分析
一.分离纯化血液制品
分离纯化血液制品
低温乙醇法
液质联用(HPLC-MS)
研究复杂成分药物体内代谢更敏感特异高效，无需大量对照品，昂贵操作复杂，短期内难普及。 多选用电喷雾正离子模式(ESI+),多反应监测(MRM) 其他联用还有高效液相色谱一核磁共振联用(HPLC—NMR)、气相色谱一质谱联用(GC—Ms)等。 如：HILIC-MS/MS：NKK及代谢物，GC—Ms：多种常见毒品，RP-HPLC-MS/MS：咖啡因，咪哒唑仑及代谢物。