腺病毒介导的PML基因对银屑病样小鼠模型的作用

腺病毒介导的PML基因对银屑病样小鼠模型的作用
王琼玉;张爱军;马慧群;王世捷;马云云;邹兴伟;李蕊联
【摘要】目的研究腺病毒介导的PML基因对银屑病样小鼠模型的作用.方法采用小鼠阴道上皮及鼠尾鳞片表皮实验模型,观察PML基因重组腺病毒乳膏外用对鼠尾鳞片及阴道上皮细胞分裂的影响.结果 PML基因重组腺病毒乳膏具有显著抑制阴道上皮细胞有丝分裂、促进表皮颗粒层生成的作用.结论 PML基因对银屑病样小鼠模型的作用可能与促进表皮细胞正常分化和抑制表皮细胞增殖有关,PML基因局部外用有望用于银屑病等角化异常性疾病的治疗.%Objective To investigate the effects of topical treatment with adenovirus-mediated promyelocytic leukemia gene (PML) gene in a psoriasis-like mouse model. Methods The effect of adenovirus-mediated PML gene on the granular layer of mouse tail scale epidermis and epithelial mitosis were observed on longitudinal histological sections prepared from the tail skin and vaginal epithelium of the mice. Results Adenovirus-mediated PML gene significantly inhibited mitosis of mouse vaginal epithelial cells and promoted the formation of granular layer in mouse tail scale epidermis. Conclusion The therapeutic effect of PML gene in the psoriasis-like mouse model may be associated with increased granular cells and suppressed epidermic cell proliferation.【期刊名称】《南方医科大学学报》
【年(卷),期】2013(033)003
【总页数】4页(P432-435)
【关键词】银屑病;PML基因;动物模型
【作者】王琼玉;张爱军;马慧群;王世捷;马云云;邹兴伟;李蕊联
【作者单位】西安交通大学第二附属医院皮肤科,陕西西安710004
【正文语种】中文
银屑病是皮肤科常见多发病，病程慢性，易复发，缺乏特效的治疗方法。

银屑病以皮肤角质形成细胞（KC）增殖和分化异常为特点，被认为是一种角质形成细胞良
性增殖性疾病［1］。

早幼粒细胞性白血病（promyelocytic leukemia,PML）基
因具有生长抑制、诱导凋亡、转录调节等生物学效应，对某些肿瘤具有明显的生长抑制作用［2-3］，但其对银屑病的作用还不清楚，关于它应用于皮肤病治疗的研究也未见报道。

我们将PML基因重组腺病毒外用于小鼠阴道上皮有丝分裂模型及小鼠尾部鳞片表皮模型，观察其治疗银屑病的可能性，并对其作用机制进行了分析。

1 材料与方法
1.1 材料
PML基因重组腺病毒(Ad-PML)由西安交通大学医学院第一医院泌尿外科研究所贺大林教授馈赠。

1.2 实验动物
昆明种二级小白鼠，体质量23～27 g，第四军医大学实验动物中心提供。

1.3 药物和试剂
配制108、109、1010Pfu/ml浓度的Ad-PML 乳膏各40 g，4℃保存；空白软膏基质由西安交通大学医学院第二附属医院制剂室制备；乙烯雌酚注射液，广州白云山明兴制药有限公司，批号051001，规格2 mg/ml；秋水仙碱原粉，国药集团
化学试剂有限公司，批号WS20060329。

丙酸氯倍他索软膏（CBT）芜湖三益制
药有限公司，批号X003921。

1.4 方法［4］
1.4.1 Ad-PML基因乳膏外用对雌激素期小鼠阴道上皮有丝分裂的影响取昆明种健康雌性小白鼠50只，将小鼠随机分成5组，每组10只。

分别为空白组（阴性对
照组）、108Pfu/ml Ad-PML乳膏组、109Pfu/ml Ad-PML乳膏组、
1010Pfu/ml Ad-PML乳膏组、丙酸氯倍他索软膏（阳性对照组）。

各组均腹腔注射乙烯雌酚，0.2 mg/次，1次/d，3 d后隔日注射1次，使小鼠阴道上皮处于雌
激素期。

各组从注射乙烯雌酚第3天起分别涂抹108Pfu/ml Ad-PML乳膏、
109Pfu/ml Ad-PML乳膏、1010Pfu/ml Ad-PML乳膏、丙酸氯倍他索软膏（阳
性对照）、空白软膏基质（阴性对照）于小鼠阴道，剂量为每只50 μg/次，2次
/d，连续14 d。

基于动物细胞有丝分裂的昼夜节律性，每组实验时间均进行统一，最后1次给药时间规定在上午8时，上午9时每鼠腹腔注射秋水仙碱2 mg/kg，使有丝分裂停止于M期的中期以便于计数。

6 h后脱颈椎处死小鼠，取阴道标本
以10%福尔马林固定，石蜡包埋，HE染色。

用光学显微镜观察细胞有丝分裂，计数300个基底细胞的有丝分裂数，并算出每100个细胞的有丝分裂数，称为有丝分裂指数。

1.4.2 Ad-PML乳膏外用对小鼠尾部鳞片表皮角化过程的影响取昆明种健康小白鼠50只，雌雄各半，随机分成5组，每组10只。

分别为108Pfu/ml Ad-PML乳膏组、109Pfu/ml Ad-PML乳膏组、1010Pfu/ml Ad-PML乳膏组、丙酸氯倍他索
软膏组（阳性对照）和空白软膏基质组（阴性对照）。

分别将108Pfu/ml Ad-PML乳膏、109Pfu/ml Ad-PML乳膏、1010Pfu/ml Ad-PML乳膏、丙酸氯倍他索软膏、空白乳膏基质外涂于小鼠尾部，2次/d，连续14 d。

脱颈椎处死小鼠，
取样检测取距离尾根约2 cm处尾背面皮肤一长条（0.1 cm×0.5 cm）。

用10%
福尔马林固定，石蜡包埋，HE染色。

在光学显微镜下逐一观察每鼠的尾部鳞片。

凡是一个鳞片有连接成行的颗粒层细胞者，称为有颗粒层的鳞片。

计数每100个
鳞片中有颗粒层的鳞片数。

1.5 统计学分析
所有计量资料以均数±标准差表示，结果以组间t检验进行统计学处理(SPSS17.0
软件)。

2 结果
2.1 Ad-PML对小鼠尾部鳞片颗粒层形成的影响
阴性对照小鼠尾部鳞片角质层角质细胞保留核，并见有较多角质栓。

颗粒层颗粒细胞缺失，仅在毛囊外有少量的颗粒细胞，表皮较薄，表现为灶性角化过度，角化不全。

基底层细胞稀疏。

各药物实验组均呈现不同程度的下列组织改变：出现数层颗粒细胞，细胞肥大，呈菱形；颗粒粗大，深染，细胞界限清楚，核及核仁明显可见。

棘细胞也明显体积增大，数量增多。

基底层细胞排列致密、整齐，核相对显小，表皮厚度相应增加（图1、2）。

实验组有颗粒层的鳞片数显著多于阴性对照组，且Ad-PML对颗粒层形成的作用随剂量的增大而增强（P<0.01 ，表1）。

图1 阴性对照组小鼠尾部表皮颗粒层Fig.1 Granular layer of tail scales in mice of negative control group(Original magnification:×100).图2外用
1010Pfu/mlAd-PML乳膏组小鼠尾部表皮颗粒层Fig.2 Granular layer of tail scales in mice after application of 1010Pfu/ml Ad-PML emulsion(Original magnification:×400).
2.2 Ad-PML对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的影响
不同浓度Ad-PML乳膏、丙酸氯倍他索软膏均对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂具有
显著的抑制作用（图3、4)，其有丝分裂指数均显著地低于阴性对照组（P<0.01，表2），并呈一定的量-效依赖关系。

表1 不同浓度的Ad-PML乳膏对小鼠尾部颗粒层形成的影响Tab.1 Effects of
Ad-PML emulsion on formation of granular layer of tail scales in
mice(n=10)*vs 109pfu/mlAd-PML group.Number of scale with granular layer/100 scale epidermis cells(x±s)Group vs negative control vs positive control Comparison amongAd-PML groups*t P t P t P Negative control
5.85±1.21 - - - - - -Positive control 28.21±1.20 41.41 <0.01 - - - -
108Pfu/mlAd-PML 22.50±1.31 29.39 <0.01 10.18 <0.01 10.53 <0.01
109Pfu/mlAd-PML 28.32±1.16 42.26 <0.01 0.22 >0.05 - -1010Pfu/mlAd-PML 28.97±2.73 24.46 <0.01 0.81 >0.05 6.76 >0.05
图3 阴性对照组小鼠阴道上皮有丝分裂表现Fig.3 Mitosis of vaginal epithelial cells in mice of negati ve control group(Original magnification:×400).图4外用1010Pfu/ml Ad-PML乳膏组小鼠阴道上皮细胞有丝分裂表现Fig.4 Mitosis of vaginal epithelial cells in estrogen-treated mice after application of
1010Pfu/ml Ad-PML emulsion(Original magnification:×400).
2.3 不良反应
各组小鼠阴道粘膜和尾部均未见红肿、糜烂等严重刺激性反应。

3 讨论
银屑病以表皮角质形成细胞过度增生、角化不全及真皮炎细胞浸润为主要病理改变，迄今还没有各方面都较理想的药物［5-7］。

PML基因编码的蛋白质是一种核蛋白，与其它核体成分共同形成PML核体。

PML核体参与细胞转录、凋亡、衰老的关键过程，也调节细胞DNA损伤及对微生物病毒等的防御。

在正常或肿瘤细胞中，PML核体通过调节AKT信号途径来实现干细胞的自我更新［8-10］。

我们前期研究发现，进行期银屑病基底上层中的PML基因可抑制角质形成细胞的增殖，并诱导凋亡，使增生银屑病表皮变薄，PML基因在介导维A酸对银屑病的治疗中起关
键作用［11］。

这些结果提示,应用PML基因也许是一种治疗银屑病的新途径，但国内外缺少动物及临床的相关研究。

银屑病的病因和发病机制尚不明确，迄今没有理想的银屑病动物模型［12］。

Jarrett和Spearman用小鼠尾部鳞片表皮模拟银屑病的表皮分化不全，是目前国内外公认的评价银屑病药物疗效的实验动物模型［13］。

药物若能抑制小鼠阴道上皮有丝分裂和促进鼠尾鳞片颗粒层形成，可推测其能改变银屑病的表皮增生和角化不全，就可能具有治疗银屑病的作用。

我们的实验结果表明，Ad-PML局部外用后小鼠阴道上皮细胞未呈现细胞毒作用，其有丝分裂指数显著低于阴性对照组（P<0.01），说明Ad-PML是通过抑制阴道上皮细胞的有丝分裂而抑制其增生，而并非是细胞毒途径；不同剂量的Ad-PML均可促进小鼠尾部表皮鳞片颗粒层的形成，增生的颗粒层细胞体积增大，数量上和层次上均增多，实验组有颗粒层的鳞片数均显著多于阴性对照组（P<0.01）；高剂量Ad-PML（1010Pfu/ml）作用最强,中、高剂量Ad-PML已接近丙酸氯倍他索的作用强度，两两比较差异无显著性（P>0.05）；而中剂量Ad-PML（109Pfu/ml）对于这两种模型的作用强度显著高于低剂量Ad-PML（108Pfu/ml），有统计学差异，说明Ad-PML的作用呈一定的量-效依赖关系。

因此推测Ad-PML基因对银屑病表皮细胞增生、角化不全等主要病理表现，将具有明显治疗作用，且动物实验显示局部外用Ad-PML后刺激等不良反应轻微，故Ad-PML基因的作用可能为银屑病的治疗提供新的思路和选择。

表2 不同浓度的Ad-PML乳膏对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的影响Tab.2 Effects of Ad-PML cream on mitosis of vaginal epithelial cells in estrogen-treated mice(n=10)*vs 109pfu/mlAd-PML group.Group Mitotic index(number of cells in metaphase/100 basal cells)(x±s)vs negative control vs positive control Comparison amongAd-PML groups*t P t P t P Negative control
16.76±1.28 - - - - - -Positive control 6.70±0.94 20.00 <0.01 - - - -
108Pfu/mlAd-PML 10.40±1.93 8.69 <0.01 5.47 <0.05 6.27 <0.05
109Pfu/mlAd-PML 5.93±1.17 19.73 <0.01 1.60 >0.05 - -1010Pfu/mlAd-PML 5.84±0.92 21.94 <0.01 2.05 >0.05 0.19 >0.05
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