实验5质粒DNA的双酶切
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〔2)防止由于标签脱落,分不清样品类型. 5．由于温差原因,往往在盖上有水汽,因此样品酶切完毕或中间取样电泳 要离心2秒钟,以集中体积内溶液,否则会发现酶切后体积少了.
在酶切实验中需要注意的事项
1 反应Buffer 2 酶切位点的保护碱基 3 酶切反应温度 4 酶切体系的体积
3．凡用在酶切反应中的一切塑料器皿〔Eppendorf管,Tip头等), 都要新的,最后用重蒸水清洗,湿热灭菌,置50℃温箱中烘干,使用前打 开包装,用镊子夹取,不直接用手去拿,严防手上杂酶污染. 4．当样品在37℃与65℃保温时,要注意：
〔l)防止因盖子未盖严密使水汽进入管内,使反应溶液体积大量增 加,造成实验失败.
➢ Ⅱ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序,并在该顺序内 的固定位置上切割双链,是DNA重组技术中最常用的工具酶 之一.识别的专一核苷酸顺序最是4个或6个核苷酸,少数也有 识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸 的.Ⅱ型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序,即有 一个中心对称轴,从这个轴朝二个方向"读"都完全相同.
限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要 工具,常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端 修饰酶等一起称为工具酶
限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶
限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切 断核酸的情况不同,分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型
特性
I 型酶
II 型酶
III 型酶
限制和修饰活性 单一多功能的酶
是 十分有用
是 有用
➢ Ⅰ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序, 并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA 分子中的双链,但是切割的核苷酸顺序没有 专一性,是随机的.这类限制性内切酶在DNA 重组技术或基因工程中用处不大,无法用于 分析DNA结构或克隆基因.这类酶如EcoB、 EcoK等.
➢ Ⅲ型限制性内切酶也有专一的识别顺序,但 不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个 核苷酸对的固定位置上切割双链.但这几个 核苷酸对不是特异性的.因此,这种限制性内 切酶切割后产生的一定长度DNA片段,具有 各种单链末端.因此不能应用于基因克隆.
3. 凝胶成像系统记录结果〔电泳图)
［注定事项］
1．分子克隆是微量操作技术,DNA样品与限制性内切酶的用量都 极少,必须Байду номын сангаас格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中.
2．要注意酶切时加样的次序,一般次序为水、缓冲液、DNA各项 试剂,最后才加酶液.取液时,Tip头要从溶液表面吸取,以防止Tip头沾 去过多的液体与酶,待用的内切酶要放在冰浴内,用后盖紧盖子,立即 放回-20℃冰箱,防止限制性内切酶的失活.
四、实验步骤
1. 质粒DNA的双酶切
反应体系：
10×H 2μL Buffer
质粒DNA 10μL～12μL≤1μg
无菌水 6μL ～ 4μL
EcoRⅠ 1μL
XhoⅠ
1μL
总体积
反应条件：温度37℃,
20μL（无菌水补至总 体积）
酶切1.5h
25 °C
37 °C
2. 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果
制备1％琼脂糖凝胶〔含 0.5μg/mLEB),120V 电泳20分钟〔最高电压不超过5V/cm).
五、思考题
Ⅱ型限制性内切酶识别序列的特点是什么？这种 酶的切割有两种方式,两种切割方式分别产生怎样 的末端？
影响限制性内切酶活性的因素有哪些？
［注定事项］
1．分子克隆是微量操作技术,DNA样品与限制性内切酶的用量都极少,必 须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中.
2．要注意酶切时加样的次序,一般次序为水、缓冲液、DNA各项试剂,最 后才加酶液.取液时,Tip头要从溶液表面吸取,以防止Tip头沾去过多的液体 与酶,待用的内切酶要放在冰浴内,用后盖紧盖子,立即放回-20℃冰箱,防止限 制性内切酶的失活.
平头末端：Ⅱ型酶切割方式的另一种是在同一位置 上切割双链,产生平头末端.例如EcoRV 的识别位置 是：
5’…… GAT’|ATC …… 3’
影响限制性内切酶活性的因素
• DNA的纯度 • DNA的甲基化程度 • 酶切消化反应的温度 • DNA的分子结构 • 溶液中离子浓度及种类 • 缓冲液的pH值
双酶切的两种酶介绍
XhoⅠ酶〔TaKaRa公司) 识别序列和切割位点：
EcoRⅠ酶〔TaKaRa公司) 识别序列和切割位点：
三、仪器、材料与试剂
水浴锅 移液枪和枪头 制冰机 浮板 R-pGEX-4T-1质粒DNA XhoⅠ酶 EcoRⅠ酶 10×H Buffer 无菌水 小离心管
实验五：质粒DNA的双酶切 与电泳检测
一、实验目的
通过本实验掌握质粒DNA双酶切 的原理和操作方法
二、实验原理
限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性 核酸序列的DNA水解酶.每一种内切酶能识别 DNA分子中由4～6个核苷酸组成的特定序列
寄主控制的限制与修饰现象
多种细菌能合成限制性内切酶,这是它们 保护自己,降解外来DNA分子的重要手段.细 菌细胞内的DNA由于相应序列上的A或C碱 基的甲基化而不被限制性内切酶攻击,而外 源DNA一旦进入细胞则立即被识别,双股 DNA螺旋都被切断.
• DNA marker 2000〔TaKaRa公司)
• 琼脂糖
• 1×TAE • 10mg/mL溴化乙锭溶液〔EB)〔0.5μg/mL终浓
度,20mL胶加1μL)
• 10×Loading Buffer:
• 1%SDS/50%Glycerol<甘油>/ 0.05% Bromophenol Blue <溴酚蓝>
3．凡用在酶切反应中的一切塑料器皿〔Eppendorf管,Tip头等),都要新 的,最后用重蒸水清洗,湿热灭菌,置50℃温箱中烘干,使用前打开包装,用镊子 夹取,不直接用手去拿,严防手上杂酶污染. 4．当样品在37℃与65℃保温时,要注意：
〔l)防止因盖子未盖严密使水汽进入管内,使反应溶液体积大量增加,造成 实验失败.
〔2)防止由于标签脱落,分不清样品类型. 5．由于温差原因,往往在盖上有水汽,因此样品酶切完毕或中间取 样电泳要离心2秒钟,以集中体积内溶液,否则会发现酶切后体积少了.
实验分组
每组4人,全班约7～8组.选择上次实验提取的质 粒DNA〔检测时条带较亮的)进行实验.
移液枪和枪头每组1套.浮板每班2块. 全班制备1块30mL 1％琼脂糖凝胶.
粘性末端：是交错切割,结果形成两条单链末端,这 种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,所以称 为粘性末端.
如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G’AA|TTC ……3’ 3’…… C T T|AA’G …...5’ |表示中心对称轴,从两侧"读"核苷酸顺序都是
GAATTC或CTTAAG,这就是回文顺序. ‘表示在 双链上交错切割的位置,切割后生成两个DNA片段, 各有一个单链末端,两条单链是互补的,其断裂的磷 酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而"粘 合"
蛋白质结构
3种不同的亚基
辅助因子
ATP、Mg2+、
寄主特异性位点序 列
EcoB:TGANTGCT
单一的成分 单一的成分
Mg2+ 旋转对称
2种不同的亚基 2种不同的亚基 ATP、Mg2+、
EcoP1:AGACC
切割位点
距特异性位点至少 位于特异性位点 距特异性位点
序列特异性切割
在DNA克隆中的 用途
不是 无用
在酶切实验中需要注意的事项
1 反应Buffer 2 酶切位点的保护碱基 3 酶切反应温度 4 酶切体系的体积
3．凡用在酶切反应中的一切塑料器皿〔Eppendorf管,Tip头等), 都要新的,最后用重蒸水清洗,湿热灭菌,置50℃温箱中烘干,使用前打 开包装,用镊子夹取,不直接用手去拿,严防手上杂酶污染. 4．当样品在37℃与65℃保温时,要注意：
〔l)防止因盖子未盖严密使水汽进入管内,使反应溶液体积大量增 加,造成实验失败.
➢ Ⅱ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序,并在该顺序内 的固定位置上切割双链,是DNA重组技术中最常用的工具酶 之一.识别的专一核苷酸顺序最是4个或6个核苷酸,少数也有 识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸 的.Ⅱ型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序,即有 一个中心对称轴,从这个轴朝二个方向"读"都完全相同.
限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要 工具,常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端 修饰酶等一起称为工具酶
限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶
限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切 断核酸的情况不同,分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型
特性
I 型酶
II 型酶
III 型酶
限制和修饰活性 单一多功能的酶
是 十分有用
是 有用
➢ Ⅰ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序, 并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA 分子中的双链,但是切割的核苷酸顺序没有 专一性,是随机的.这类限制性内切酶在DNA 重组技术或基因工程中用处不大,无法用于 分析DNA结构或克隆基因.这类酶如EcoB、 EcoK等.
➢ Ⅲ型限制性内切酶也有专一的识别顺序,但 不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个 核苷酸对的固定位置上切割双链.但这几个 核苷酸对不是特异性的.因此,这种限制性内 切酶切割后产生的一定长度DNA片段,具有 各种单链末端.因此不能应用于基因克隆.
3. 凝胶成像系统记录结果〔电泳图)
［注定事项］
1．分子克隆是微量操作技术,DNA样品与限制性内切酶的用量都 极少,必须Байду номын сангаас格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中.
2．要注意酶切时加样的次序,一般次序为水、缓冲液、DNA各项 试剂,最后才加酶液.取液时,Tip头要从溶液表面吸取,以防止Tip头沾 去过多的液体与酶,待用的内切酶要放在冰浴内,用后盖紧盖子,立即 放回-20℃冰箱,防止限制性内切酶的失活.
四、实验步骤
1. 质粒DNA的双酶切
反应体系：
10×H 2μL Buffer
质粒DNA 10μL～12μL≤1μg
无菌水 6μL ～ 4μL
EcoRⅠ 1μL
XhoⅠ
1μL
总体积
反应条件：温度37℃,
20μL（无菌水补至总 体积）
酶切1.5h
25 °C
37 °C
2. 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果
制备1％琼脂糖凝胶〔含 0.5μg/mLEB),120V 电泳20分钟〔最高电压不超过5V/cm).
五、思考题
Ⅱ型限制性内切酶识别序列的特点是什么？这种 酶的切割有两种方式,两种切割方式分别产生怎样 的末端？
影响限制性内切酶活性的因素有哪些？
［注定事项］
1．分子克隆是微量操作技术,DNA样品与限制性内切酶的用量都极少,必 须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中.
2．要注意酶切时加样的次序,一般次序为水、缓冲液、DNA各项试剂,最 后才加酶液.取液时,Tip头要从溶液表面吸取,以防止Tip头沾去过多的液体 与酶,待用的内切酶要放在冰浴内,用后盖紧盖子,立即放回-20℃冰箱,防止限 制性内切酶的失活.
平头末端：Ⅱ型酶切割方式的另一种是在同一位置 上切割双链,产生平头末端.例如EcoRV 的识别位置 是：
5’…… GAT’|ATC …… 3’
影响限制性内切酶活性的因素
• DNA的纯度 • DNA的甲基化程度 • 酶切消化反应的温度 • DNA的分子结构 • 溶液中离子浓度及种类 • 缓冲液的pH值
双酶切的两种酶介绍
XhoⅠ酶〔TaKaRa公司) 识别序列和切割位点：
EcoRⅠ酶〔TaKaRa公司) 识别序列和切割位点：
三、仪器、材料与试剂
水浴锅 移液枪和枪头 制冰机 浮板 R-pGEX-4T-1质粒DNA XhoⅠ酶 EcoRⅠ酶 10×H Buffer 无菌水 小离心管
实验五：质粒DNA的双酶切 与电泳检测
一、实验目的
通过本实验掌握质粒DNA双酶切 的原理和操作方法
二、实验原理
限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性 核酸序列的DNA水解酶.每一种内切酶能识别 DNA分子中由4～6个核苷酸组成的特定序列
寄主控制的限制与修饰现象
多种细菌能合成限制性内切酶,这是它们 保护自己,降解外来DNA分子的重要手段.细 菌细胞内的DNA由于相应序列上的A或C碱 基的甲基化而不被限制性内切酶攻击,而外 源DNA一旦进入细胞则立即被识别,双股 DNA螺旋都被切断.
• DNA marker 2000〔TaKaRa公司)
• 琼脂糖
• 1×TAE • 10mg/mL溴化乙锭溶液〔EB)〔0.5μg/mL终浓
度,20mL胶加1μL)
• 10×Loading Buffer:
• 1%SDS/50%Glycerol<甘油>/ 0.05% Bromophenol Blue <溴酚蓝>
3．凡用在酶切反应中的一切塑料器皿〔Eppendorf管,Tip头等),都要新 的,最后用重蒸水清洗,湿热灭菌,置50℃温箱中烘干,使用前打开包装,用镊子 夹取,不直接用手去拿,严防手上杂酶污染. 4．当样品在37℃与65℃保温时,要注意：
〔l)防止因盖子未盖严密使水汽进入管内,使反应溶液体积大量增加,造成 实验失败.
〔2)防止由于标签脱落,分不清样品类型. 5．由于温差原因,往往在盖上有水汽,因此样品酶切完毕或中间取 样电泳要离心2秒钟,以集中体积内溶液,否则会发现酶切后体积少了.
实验分组
每组4人,全班约7～8组.选择上次实验提取的质 粒DNA〔检测时条带较亮的)进行实验.
移液枪和枪头每组1套.浮板每班2块. 全班制备1块30mL 1％琼脂糖凝胶.
粘性末端：是交错切割,结果形成两条单链末端,这 种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,所以称 为粘性末端.
如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G’AA|TTC ……3’ 3’…… C T T|AA’G …...5’ |表示中心对称轴,从两侧"读"核苷酸顺序都是
GAATTC或CTTAAG,这就是回文顺序. ‘表示在 双链上交错切割的位置,切割后生成两个DNA片段, 各有一个单链末端,两条单链是互补的,其断裂的磷 酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而"粘 合"
蛋白质结构
3种不同的亚基
辅助因子
ATP、Mg2+、
寄主特异性位点序 列
EcoB:TGANTGCT
单一的成分 单一的成分
Mg2+ 旋转对称
2种不同的亚基 2种不同的亚基 ATP、Mg2+、
EcoP1:AGACC
切割位点
距特异性位点至少 位于特异性位点 距特异性位点
序列特异性切割
在DNA克隆中的 用途
不是 无用