双抗夹心ELISA测沙门氏菌(课件)1

几种酶标分析仪
DNM-9602G酶标分析仪
DNM-9602A酶标分析仪
DNM-9602 标配酶标分析仪
ELISA的基本原理
它采用抗原与抗体的特异反应将待测物 与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应， 用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可 以是抗原。 在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但 仍保留其免疫活性。然后加一种抗体（抗原）与酶结 合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫 活性与酶活性。当偶联物与固相载体上的抗原（抗体） 反应结合后， 再加上酶的相 应底物，即起 催化水解或氧 化还原反应而 呈颜色，其所 生成的颜色深 浅与欲测的抗 原（抗体）含 量成正比。
4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG) 黄色 红色 黄色 深蓝色 荧光 黄色 400 500 405 420 360,450 420 碱性磷酸酯酶 葡萄糖氧化酶 β-Ｄ－半乳糖 苷酶
为什么ELISA反应总是需要一定时间 的温育？
ELISA 属固相免疫测定，抗原、抗体、二 抗等在固相属上的结合是一个扩散和平衡的 过程，因此需一定时间才能达到反应的终点 。在其后加入的酶标记抗体与酶底物的结合 也同样如此。温育常采用的温度有43℃、 37℃、室温和4℃等。37℃是实验室中常用的 保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适 温度。
酶结合物是酶与抗体或抗原 ,橘红色 半抗原在交 辣根过氧化物酶 邻苯二胺 492 联剂作用下联结的产物。是 ELISA成败的关键试 四甲基联苯胺(TMB) 黄色 450 氨基水杨酸 棕色 剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还 449 邻联苯甲胺 兰色 425 具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻 蓝绿色 642 的酶选用不同的底物 ，将得到不同的颜色反应 唑啉磺酸-6)铵盐 .
结果判定
有效性： 阳性对照孔平均值＞1.00； 阴性对照孔平均值＜0.15
• 阳性判定值（cut-off value）= 阴性对照
OD值的平均数（NCX）+ 0.15
• 样品OD值＞阳性判定值的为沙门阳性；
• 样品OD值≤阳性判定值的为沙门阴性。
注意事项
加样：悬空加样，枪头不可以接触酶标板，及时 更换枪头;将所加物加在ELISA板孔的底部，并注意 不可溅出，不可产生气泡。 洗板：每次洗液加入后，应迅速将洗板倒扣用力 甩干。
疾病诊断(乙肝病毒,风湿性关 其他应用 节炎等)
ELISA试剂盒
固相载体
• 最常用的是聚苯乙烯：有较强的吸附蛋白质的性能；
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国际上标准的是微量滴定板8×12的96孔板式；
已经包被抗原或者抗体的固相载体在低温（2-8℃）干燥 的条件下一般可以保存6个月。
酶及其底物 酶 底 物
显色 反应 测定波长
彻底洗涤 未结合的 酶标抗体
加底物进行 酶催化反应
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
为什么洗涤在ELISA过程中决定着实验的 成败？
• 聚苯乙烯等塑料对蛋白的吸附是普遍的，洗 涤可以清除在反应过程中非特异性吸附于固 相载体的干扰物质
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洗涤可以清除残留在板孔中没有能够与固相 抗原或者抗体结合的物质
常加入非离子表面活性剂（含有疏水基团+亲 水基团），以抑制蛋白质吸附于塑料表面。
显色和比色
显色是ELISA中的最后一步孵育反应，此时，酶催化无色的底 物生成有色的产物； • 定量实验中，加入底物后的反应温度和时间应该按规定力求 准确；定性测定的显色时间一般不需要严格控制和及时判断 ；
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终止反应，防止反应过度：
HRP的色原底物系统
预期结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
显色 终止
空白 阳性 阴性 待测 在酶标仪上，于450nm波长、630nm参比滤光片 条件，读出标本（sample，S）、阳性对照（P）、 和阴性对照（N）的吸光值(OD值)，通过阳性判定 值法进行定性分析。
光源发出的全波谱经过滤光片后，大部分被 过滤只剩下滤光片本身容许的波长通过滤光片 ，这样就可以通过滤光片来获得特定的波长。 滤光片轮一般含有4~6块滤光片，通过选择不 同的滤光片可获得不同的波长，获得波长都是 固定的受到一定的限制，一般波长固定的滤光 片有405，450，490，630nm。
二.特异性
其特异性来自抗体或抗原的专一性结合。
三.简单、快速及易于自动化操作
ELISA在食品安全检测中的应用 微生物的检测(如沙门氏菌, 大肠杆菌O157:H7,金黄
色葡萄球菌,李斯特氏菌,致病性弧菌等) 动植物毒素(如河豚毒素,吗啡,藻类毒素等) 农药农残检测
ELISA在饲料安全检测中的应用
抗生素的测定(如新霉素,氯霉素等) 微生物毒素的测定（如黄曲霉毒素,赭曲霉毒素等） 违法添加剂的测定(如盐酸克伦特罗,孔雀石绿等)
实验步骤
获得待分析物的未标定抗体
将特异性抗体 与固相载体连接 形成固相抗体
洗涤除去未结合的 抗体及杂质
加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点
洗涤并除去未结合的封闭蛋白
加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物
洗涤除去其他 未结合的物质
加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体 的复合物
双抗体夹心法 原理
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
抗原或抗体的固相化：已知的Ag/Ab结合到固相载体表面，并保持其免疫活性； 加受检标本：保温反应，标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合
物
抗原或抗体的酶标记：酶标Ag/Ab,保温反应，并保持其免疫活性和酶活性； 底物显色：底物被酶催化成为有色产物—定性和定量– 放大免疫反应的信号
实验四
双抗夹心ELISA检测沙门氏菌
实验目的
• 掌握酶联免疫吸附实验的基本原理 • 了解利用双抗体夹心法测定沙门氏菌的方 法
ISA简介
1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷 兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将 免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免 疫测定法,即酶联免疫吸附测定法(EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay, ELISA)。 ELISA现在已成为目前分析化学领域中的 前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析方法， 是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型 的免疫测定技术 。
免疫标记技术
放射物标记技术 酶标技术 免疫荧光技术
其他标记
酶联免疫吸附技术
酶免疫组化技术
双抗体夹心法
间接法
竞争法 双抗原夹心法
双位一点法
ELISA的特点
一.灵敏性
其灵敏性来自酶的高效催化特性，产生可供观 察的显色反应现象。 ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原 或抗体，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。
液体全部加完后，可将酶标板在桌子上平行轻轻 晃动30秒，混匀液体。
底物有毒性，终止液对皮肤有腐蚀性，尽量避免 接触
思考题
（1）ELISA反应为什么多步需要一定时间的 孵育？为什么孵育温度常采用37℃？
（2）为什么洗涤在ELISA过程中决定着实验 的成败？
（3）为什么双抗夹心ELISA不能用于小分子 抗原测定？