高效液相色谱法同时检测生物样品中利多卡因和MEGX

高效液相色谱法同时检测生物样品中利多卡因和MEGX
李江涛;严鹏;尉志文;贠克明
【摘要】目的建立生物样品中同时测定利多卡因及其代谢产物单乙基甘氨酰二甲苯胺(MEGX)的高效液相色谱分析方法.方法待测生物样品血液或组织脏器中加入内标物普鲁卡因,酸化,碱化后,用乙醚提取两次,挥干,定容,用保留时间定性,内标法、工作曲线法进行定量.结果心血和肝脏中利多卡因液相色谱检测的回归方程分别为Y=0.217X+0.019和Y=0.214X+0.113,相关系数分别为0.996和0.988,线性检测范围均为(0.2~100)μg/mL(μg/g)、最低检出浓度分别为0.05 μg/mL;心血和肝脏中MEGX液相色谱检测的回归方程分别为Y=0.514X+0.033和Y=0.440X+0.292,相关系数分别为0.995和0.993,线性检测范围均为(0.2~20)μg/mL、最低检出浓度分别为0.05 μg/mL.心血利多卡因及MEGX含量分别为(14.50±1.64)μg/mL和
(1.64±0.22)μg/mL,肝脏利多卡因及MEGX含量分别为(14.90±1.19)μg/mg和
(2.53±0.36)μg/mg.结论建立了生物样品中同时测定利多卡因及MEGX的HPLC 分析方法,所建方法简便、灵敏、重现性好,可用于利多卡因中毒的快速诊断和利多卡因麻醉意外的法医学鉴定.
【期刊名称】《中西医结合心脑血管病杂志》
【年(卷),期】2012(010)012
【总页数】2页(P1498-1499)
【关键词】利多卡因;单乙基甘氨酰二甲苯胺;高效液相色谱法;生物检材
【作者】李江涛;严鹏;尉志文;贠克明
【作者单位】山西医科大学法医学院,030001;山西医科大学法医学院,030001;山西医科大学法医学院,030001;山西医科大学法医学院,030001
【正文语种】中文
【中图分类】R969.1
利多卡因（Lidocaine）是椎管内麻醉常用的酰胺类药物，由于椎管内结构特殊等原因［1，2］，由利多卡因所引起麻醉意外等人身伤亡案例［3－5］时有发生。

利多卡因入体后大部分经肝药酶（细胞色素P450）代谢为单乙基甘氨酰二甲苯胺（MEGX），MEGX影响着利多卡因的疗效及毒性［6，7］，同时检测利多卡因和MEGX含量对多卡因麻醉意外的法医学鉴定意义重大。

本实验建立生物检材中利多卡因和MEGXA的高效液相色谱法（HPLC）检测方法，并应用于利多卡因麻醉意外法医毒物动力学研究。

1 材料与方法
1.1 试剂及仪器盐酸利多卡因注射液（2%，国药准字H31021071）购于上海复星朝晖药业有限公司，利多卡因标准品购自公安部物证鉴定中心（Lot：
SW1083），MEGX标准品购自公安部物证鉴定中心（Lot：6938292），普鲁卡因标准品购自公安部物证鉴定中心，甲醇为TEDIA公司生产。

除甲醇为色谱纯，其他均为分析纯。

日本岛津LC－20AT高效液相色谱仪，Dikma迪马科技C18二代色谱柱，SPD－20A紫外检测器，N3000色谱工作站。

1.2 仪器分析条件 Dikma C18柱（迪马科技5μm；250 mm×4.6 mm）；柱温25℃；流动相：甲醇：磷酸缓冲液（15 mmol/L，p H＝3）＝30：70；检测波长229 nm；流速1 m L/min；进样量20μL；工作站：N3000色谱工作站。

1.3 给药方案和样品采集健康本地犬9只，蛛网膜下腔注射组（6只）和对照组（3只）。

蛛网膜下腔注射组：蛛网膜下腔穿刺后，于5 min内向蛛网膜下腔注
入LD50（15 mg/kg）剂量利多卡因；对照组：以等体积生理盐水代替利多卡因，其余处理同蛛网膜下腔注射组。

所有实验犬于死后即刻提取心血、肝脏待检。

1.4 心血和肝脏样品处理与分析待测固性样品1 g或血液1 m L，加蒸馏水2 m L，
固性样品超声匀浆3 min，加内标普鲁卡因50μg，振荡5 min；10%HCl调酸p H＝2～3，振荡5 min，3000 r/min离心10 min，提取上清液；上清液用
10%NaOH调碱p H＝11～12，震荡2 min，加乙醚5 m L，振荡15 min，3000 r/min离心10 min，取上层乙醚液；乙醚5 m L重复提取一次；合并乙醚液，40℃水浴挥干。

残渣用500μL甲醇定容，通过针筒式滤膜过滤器（孔径
0.45μm）过膜后，按上述仪器条件进样20μL，液相色谱工作内标工作曲线法定
量分析样品中利多卡因及MEGX。

2 结果
2.1 利多卡因、MEGX及内标普鲁卡因液相色谱图（见图1～图3）
图1 利多卡因、MEGX、普鲁卡因标准高效液相色谱图注：普鲁卡因Rt＝4.030，MEGX Rt＝10.173，利多卡因Rt＝13.228。

图2 染毒血中高效液相色谱图注：普鲁卡因Rt＝4.055，MEGX Rt＝10.246，利
多卡因Rt＝13.272。

图3 染毒肝中高效液相色谱图注：普鲁卡因Rt＝4.080，MEGX Rt＝10.077，利
多卡因Rt＝12.608。

2.2 工作曲线分别取空白心血1 m L和空白肝脏1 g各14份，置于离心管中，每管分别添加利多卡因及 MEGX各0.01 μg、0.03μg、0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.6μg、1.0μg、2.5μg、5 μg、10μg、30μg、50μg、100μg、150μg，配制成为标准系列，并依次加入内标液普鲁卡因50μg，按1.4前述方法提取与检测。

以
利多卡因或MEGX浓度（X）对利多卡因或MEGX与内标物峰面积比值（Y）作
线性回归，心血和肝脏中利多卡因液相色谱检测的回归方程分别为Y＝0.217X＋0.019和Y＝0.214X＋0.113，相关系数分别为0.996和0.988，线性检测范围均
为（0.2～100）μg/m L、最低检出浓度分别为0.05μg/m L或μg/g；心血和肝
脏中MEGX液相色谱检测的回归方程分别为Y＝0.514X＋0.033和Y＝0.440X＋0.292，相关系数分别为0.995和0.993，线性检测范围均为（0.2～20）μg/m L、最低检出浓度分别为0.05μg/m L。

2.3 精密度和提取回收率分别取含2μg、10μg、50μg的利多卡因标准甲醇溶液
和含MEGX 2μg、10μg、50μg的 MEGX标准甲醇溶液各20μL进样，每个样品每日测定5次，连续测定3 d，其日内、日间相对标准差为1.5%～2.7%和
2.0%～
3.7%。

取空白检材1 m L（1 g）/份，共9份，分别加入利多卡因和MEGX标准品
10μg与2μg（3份）、30μg与5μg（3份）、50μg与10μg（3份），按1.4
前述样品处理方法处理并检测，计算回收率。

心血中利多卡因和MEGX的回收率
为（99.3±5.0）%～（101.2±4.0）%，肝脏中利多卡因和 MEGX的回收率为（98.1±4.8）%～（104.2±4.4）%。

2.4 染毒死亡犬体内利多卡因及MEGX含量染毒死亡犬心血和肝脏经提取后，以
内标工作曲线法计算样品中
利多卡因及MEGX含量。

心血利多卡因及MEGX含量分别为（14.50±1.64）
μg/m L和（1.64±0.22）μg/m L，肝脏利多卡因及 MEGX含量分别为
（14.90±1.19）μg/mg和（2.53±0.36）μg/mg。

3 讨论
据相关文献报道，同时检测利多卡因和MEGX常使用GC［8］和HPLC［9］法。

由于 MEGX的化学性质，GC和 GC/MS在检测MEGX时，必须先进行衍生化处
理，才能进一步检测；而所报道HPLC法多采用乙腈等高成本流动相，并且检材
前处理发放繁琐［10］。

本实验建立同时检测生物检材中利多卡因和MEGX的HPLC方法，该方法在选定条件下利多卡因、MEGX、普鲁卡因（内标）能够与其他杂质峰良好分离（普鲁卡因Rt＝4.03min，MEGX Rt＝10.17 min，利多卡因
Rt＝13.228 min，分离度Rs＞2），峰形对称，分离效果好，在较高浓度范围内
有较好的线性关系，提取回收率及精密度均达到检案要求，且重现性好，检材前处理简单，灵敏度高，可用于生物检材中利多卡因和MEGX的分析测定。

有关报道中提取利多卡因是在p H为9的碱性环境［11］，但本实验发现利多卡
因和MEGX在提取环节中对p H非常敏感，利多卡因在p H为9时回收率较高，而MEGX在该p H下回收率却比较低，通过动物实验并考虑到实际案例，经反复实验，最终选用p H在11～12范围，可保证利多卡因和MEGX都具有较高回收率。

本实验结果显示，各脏器中利多卡因含量较MEGX含量高，与文献报道［12］利多卡因在蛛网膜下腔麻醉致死犬体内的含量分布一致。

本实验所建立方法能够快速准确定性定量分析样品中的利多卡因和MEGX，同时
能够应用于临床麻醉意外病人药物浓度检测，麻醉意外的法医学鉴定，以及进一步的毒（药）物动力学研究。

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